1、实验六 微生物生理生化反应观察,一、实验目的,初步了解微生物生化鉴定与分类的原理与方法；掌握淀粉水解实验、明胶水解实验、尿素水解实验、糖发酵实验的原理和方法。,二、实验原理,1.淀粉酶能水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能产淀粉酶的微生物在淀粉培养基上培养用碘处理会产生无色区域，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。,2.明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在25以上明胶会液化。如果接种的微生物能够产生明胶酶就可以使明胶生化管在25 以下发生液化，据此性质可以鉴别产明胶酶的微生物。,3. 尿素酶能够使尿素分解释放出氨气和二氧化碳
2、，氨溶于水使加有酚红酸碱指示剂的营养琼脂由中性变成碱性，从而产生颜色变化（由黄色变成深粉红色）。通过生化管的颜色变化就可以判断接种的培养基是否产生尿素酶。,4、有些微生物能够分解葡萄糖或乳糖产生有机酸（乳酸、醋酸、丙酸）使生化管的PH值降低，从而使含酸碱指示剂溴甲酚紫的营养琼脂由紫色变成黄色，通过生化管的颜色变化可以判断是否能产生相应的糖水解酶类。,三、实验步骤（二人一组）,1.淀粉水解实验：每人接种二支淀粉生化管（分别接种大肠杆菌和枯草芽孢杆菌），37培养2d，加卢革氏碘液观察和记录每管颜色变化，得出结论。,2.明胶水解实验：每人接种二支明胶生化管（分别接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌），20培
3、养2天，从20取出即观察和记录各管的明胶水解情况，得出结论。,3.尿素水解实验：每人接种两支尿素生化管（分别接种变形杆菌和金黄色葡萄球菌），37培养2天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。,4、葡萄糖发酵试验：每人接种二支葡萄糖生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形杆菌），37培养2天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。,5、乳糖发酵试验：每人接种二支乳糖生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形杆菌），37培养2天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。,四、实验注意事项,淀粉水解实验，在观察时需要加卢革氏碘液以便观察淀粉的水解情况；接种均在无菌条件下操作，接种完毕以后用灭菌
4、好的棉花塞住管口防止污染；生化管用砂轮切割玻璃后接种。,思考题,接种后的明胶试管可以在37 下培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在?对你的实验现象进行分析,示 教,肠道致病菌的分离鉴定,分离鉴定步骤,1、分离培养,粪便标本,划线分离,S-S平板,培养,大，红色，非致病性菌菌落,小，无色半透明，为可疑菌落,粪便标本,划线分离,粪便标本,划线分离,S-S平板,粪便标本,划线分离,培养,S-S平板,粪便标本,划线分离,培养,S-S平板,粪便标本,划线分离,培养,S-S平板,粪便标本,划线分离,大，红色，非致病性菌菌落,培养,S-S平板,粪便标本,划线分离,2、初步鉴定,选取可疑菌落,转种,半
5、固体，双糖铁培养基,培养,观察培养基变化,3、进一步鉴定 对初步鉴定的菌种进一步做生化鉴定4、血清学鉴定 肠道杆菌型别较多，常需血清学方法进行确证5、药敏试验 为针对性治疗提供依据,（一）肠道杆菌的形态、染色及在选择培养基上的生长情况1、常见肠道致病菌菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌等2、选择培养基：SS平板、EMB,SS琼脂培养基选择培养原理：,此培养基是强选择性培养基中性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。在此培养基上，大肠杆菌属的菌落大而混浊，因发酵乳糖，菌落呈现红色 志贺氏菌属和沙门氏菌属的菌落形态为光滑无色透明，园形、中等大小，边缘整齐的菌落。由于宋内氏痢疾杆菌有分解胆盐中的某些物质
6、和发酵乳糖(产酸)较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色的较大或边缘不整齐的扁平菌落。某些沙门氏菌属及变形杆菌因 产生硫化氢，使菌落呈现黑色中心。,伊红美兰琼脂培养基（）选择培养原理：,此培养基为弱选择性培养基。以伊红美兰作指示剂（）大肠杆菌分解乳糖产酸时染上伊红，因为伊红和美兰结合所以菌落不是红色而呈现紫黑色，且有金属光泽(大肠杆菌)或棕色(产气杆菌)，扁平混浊，而较大边缘色淡的菌落。（）致病菌的菌落为无色半透明、园形，中等大小，边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑菌落往往呈现淡兰色。,方法：,1、分离培养、观察菌落特征：分别取四的培养物，用分离划线方法接种SS平板或EMB培养基37培养18-24
7、h以后观察结果。2、革兰染色、观察形态学特征：取各菌培养物少许涂片，革兰染色、镜检。,菌落观察,SS平板,沙门氏菌：无色透明菌落，有黑色中心志贺氏菌：无色透明菌落。,肠道杆菌形态学观察,（二）肠道杆菌生化反应及动力试验,培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反应管、半固体培养基,克氏双糖斜面培养基生化反应原理,该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为1:10，并含硫酸亚铁和指示剂酚红。大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以上层呈黄色，直立段有气泡存在肠道病原菌不能发酵乳糖，只能发酵葡萄糖，分解葡萄糖产酸，使PH下降，因斜面部分先呈现黄色，由于葡萄糖含量少，所生之酸接触空气而氧化，又因细苗的生长利用含氮物质生成
8、碱性化合物，所以斜面部分后来又变成红色由于直立段(底层)呈厌氧状态，细菌发酵葡萄糖所生的酸不被氧化，所以一直呈黄色。大肠杆菌产气，有动力(沿穿刺线向周围扩散生长)伤寒杆菌有动力，而痢疾杆菌则没有动力 某些细菌如变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚铁中的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁，而痢疾杆菌不产生硫化铁,生化反应管原理（1）,尿素试验：此培养基鉴别沙门氏菌和变形杆菌属细菌，自铁质双糖培养基上取菌苔作斜面接种，置37恒温箱内培养1824小时同时作镜检观其是否为纯培养变形杆菌含有尿素酶，经24小时培养能分解培养基中较多量尿素产生大量的氨，使培养基P
9、H变为硷性，而呈现红色。即阳性反应，阳性反应可弃之。痢疾杆菌属及沙门氏菌属之细菌不能分解尿素而不呈现碱性反应即阴性反应，阴性反应 需继续作生化反应及血清学试验。,生化反应管原理（2）,糖发酵试验，细菌具有多种酶系统能分解糖类，产酸产气。不同的细菌对各种糖类的分解不同，因而可以利用糖发酵进行各种细菌(特别是肠道细菌)的鉴别。大肠杆菌能发酵乳糖、葡萄糖产酸产气。志贺痢疾杆菌、沙门氏菌、变形杆菌不分解乳糖，但能分解葡萄糖产酸。宋内氏痢疾杆菌迟缓发酵乳糖产酸，能分解葡萄糖产酸。,生化反应管原理（3）,硫化氢试验：某些细菌能分解培养基中硫氨基酸（如胱胺酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚铁中的亚铁离子结合形成
10、黑色的硫化铁，变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能产生硫化铁痢疾杆菌不产生硫化铁。,方法：,1、克氏双糖铁斜面培养基：分别取四种肠道杆菌的培养物，用穿刺加斜面划线接种方法接种于4支克氏双糖斜面培养基，37培养18-24h以后观察结果。2、生化反应管：取尿素反应管、硫化氢反应、葡萄糖反应、乳糖反应管，每种反应管分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌，37培养18-24h以后观察结果。3、动力试验：分别取四种肠道杆菌的培养物，用穿刺接种方法接种于4支半固体培养培养基，37培养18-24h以后观察结果。,+,结果观察,大肠杆菌,伤寒杆菌,痢疾杆菌,变形杆菌,克氏双糖铁,葡萄糖,乳糖,硫化氢,动 力,尿素,H2S,生化反应管,葡萄糖,乳糖,+,-,-,-,+,+,黄色,+,-,+,-,+,-,-,-,-,-,+,+,+,-,+,黄色,红色,黑色,红色,黄色,红色,黄色,黑色,+,+,+,+,+,
