1、1四、DNA 的修复DNA 修复系统 功能错配修复 恢复错配碱基切除修复 切除突变的碱基核甘酸切除修复 修复被破坏的 DNADNA 直接修复 修复嘧啶二体或甲基化DNASOS 系统 DNA 的修复，导致变异1、错配修复 （mismatch repair）Dam 甲基化酶使母链位于 5GATC 序列中腺甘酸甲基化甲基化紧随在 DNA 复制之后进行（几秒种后至几分钟内）根据复制叉上 DNA 甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基2、碱基切除修复 excision repair所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶，它能特意切除受损核苷酸上的 N- -糖苷键，在 DNA 链
2、上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP 位点。一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺，然后改变配对性质，造成氨基转换突变* 腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对* 鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对* 胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对3、核苷酸切除修复1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸3） DNA 聚合酶以母链为模板复制合成新子链4）DNA 连接酶将切口补平4 、DNA 的直接修复在 DNA 光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和 6-4 光化物还原成为单体甲基转移酶使 O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止 G-T 配对SOS 反应 (SOS response)：是细胞
3、DNA 受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，细胞为求生存而产生的 一种应急措施。* 包括诱导 DNA 损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。细胞癌变也与 SOS 反应有关。两个作用（1）DNA 的修复；（2）产生变异五、 DNA 的转座DNA 的转座或叫移位（transposition)：由可移位因子(transposable element) 介导的遗传物质重排现象。转座子（transposon Tn）：存在于染色体 DNA 上可自主复制和位移的基本单位。已经发现“转座”这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现
4、的仅仅是它的拷贝。因此，转座有别于同2源重组，它依赖于 DNA 复制。原核生物转座子的类型：1、插入序列(IS)IS 是最简单的转座子，不含有任何宿主基因，它们是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分。 2、复合转座子(composite transposon)复合转座子是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的 IS 序列 3、TnA 家族 TnA 家族没有 IS 序列、体积庞大 (5000bp 以上)、带有 3 个基因，其中一个编码 -内酰胺酶(AmpR)，另两个则是转座作用所必须的。(三）转座作用的机制 转座时发生的插入作用的普遍特征，是受体分
5、子中有一段很短的(3l2bp) 、被称为靶序列的 DNA 会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度是一样的，如 IS1 两翼总有 9 个碱基对的靶序列，而 Tn3 两端总有 5bp 的靶序列。 靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性 DNA 末端。（三）转座作用的遗传学效应 p63（1）转座引起插入突变（2）转座产生新的基因（3）转座产生的染色体畸变（4）转座引起的 生物进化反转录转座子（retrotransposon）：指通过 RNA 为中介，反转录成 DNA 后进行转座的可动元件。第三章 生物信息的传递（上） 从 DNA 到
6、RNA转录(transcription) ：生物体以 DNA 为模板合成 RNA 的过程 。参与转录的物质原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA酶: RNA 聚合酶其他蛋白质因子RNA 合成方向：5 到 3转录的不对称性：在 RNA 的合成中，DNA 的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。与 mRNA 序列相同的那条 DNA 链称为编码链；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA 合成的 DNA 链称为模板链。DNA 分子上转录出 RNA 的区段，称为结构基因。转录单元（transcription unit）一段从启动子开始至终止子结束的 DNA
7、 序列。二、参与转录起始的关键酶与元件（一） RNA 聚合酶原核生物 RNA 聚合酶（大肠杆菌为例）-全酶= 核心酶+ 因子3亚基基因 相对分子量亚基数组分 功能 rpoA 36500 2 核心酶 核心酶组装，启动子识别 rpoB 151000 1 核心酶 rpoC 155000 1 核心酶 和 共同形成RNA 合成的活性中心 ？ 11000（需查）1 核心酶 ？rpoD 70000 1 因子 存在多种 因子，用于识别不同的启动子真核细胞的三种 RNA 聚合酶特征比较酶 位置 转录产物 相对活性 对 -鹅膏蕈碱的敏感性RNA 聚合酶 核仁 rRNA 50-70%不敏感RNA 聚合酶 核质 hn
8、RNA 20-40%敏感RNA 聚合酶 核质 tRNA 约 10%存在物种特异性RNA 聚合酶与 DNA 聚合酶的区别RNA 聚合酶 DNA 聚合酶大小(M) 大，4.8105dol 小，1.09105dol引物 无 有产物 较短，游离 较长，与模板以氢键相连作用方式 一条链的某一段 两条链同时进行外切酶活性 无 5 3，3 5校对合成能力无 有修复能力 无 有（二） 启动子(promoter)启动子定义：指能被 RNA 聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA 序列。 TATA 区：酶的紧密 结合 位点（富含 AT 碱基，利于双链打开） 4TTGACA 区：提供了 RNA 聚合酶全酶 识
9、别 的信号 转录起点-与新生 RNA 链第一个核甘酸相对应 DNA 链上的碱基。真核生物启动子的结构核心启动子（core promoter）定义：指保证 RNA 聚合酶转录正常起始所必需的、最少的 DNA 序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游 TATA 区作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始2、上游启动子元件包括 CAAT 盒（CCAAT）和 GC 盒（GGGCGG）等作用：控制转录起始频率。（三） 转录起始复合物-二元闭合复合物、二元开链复合物、三元复合物。 （原核）三、转录的基本过程1、起始位点的识别：RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程。RNA 聚合酶
10、全酶( 2)与模板结合 2、转录起始RNA 聚合酶全酶( 2)与模板结合 DNA 双链解开 在 RNA 聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi转录起始复合物: RNApol ( 2) - DNA - pppGpN- OH 33、RNA 链的延伸 亚基脱落，RNA pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着 DNA 模板前移；在核心酶作用下，NTP 不断聚合，RNA 链不断延长。注意：9 个核苷酸以前还在启动子区，容易脱落，一旦形成 9 个以上的核苷酸并离开启动子区，转录正式进入眼神阶段。4、转录终止终止
11、子（terminator）：位于基因的末端，在转录终止点之前有一段回文序列（反向重复序列）约 6-20bp。 真核生物终止: 由一段特定序列 5AATAAA 3和回文序列（反向重复序列）组成。 分为两类：强终止子内部终止子：不依赖 Rho ( )因子的终止。弱终止子 需要 因子（rho factor） ，又称为 依赖性终止子（ Rho-dependent terminator）不依赖 因子的终止当 RNA 链延伸到转录终止位点时，RNA 聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA 杂合物分离，转录泡瓦解，DNA 恢复成双链状态，而 RNA 聚合酶和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转录
12、的终止。5终止位点上游一般存在一个富含 GC 碱基的二重对称区，RNA 形成发夹结构；在终止位点前面有一段由 4-8 个 A 组成的序列，RNA 的 3端为寡聚 U发夹式结构和寡聚 U 的共同作用使 RNA 从三元复合物中解离出来。依赖 因子的终止 因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生 RNA 链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。（二） 、真核生物的转录过程1. 转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol 不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。（1）. 转录起始前的上游区段 顺式作用元件(cis-acting element)：影响自身基
13、因表达活性的非编码 DNA 序列。例： 启动子、增强子、弱化子等 增强子：在启动区存在的能增强或促进转录的起始的 DNA 序列。但不是启动子的一部分。特点：1.远距离效应；2.无方向性；3.顺式调节；4.无物种和基因的特异性；5.具有组织特异性；6.有相位性；7.有的增强子可以对外部信号产生反应。（2）. 转录因子：能直接、间接辨认和结合转录上游区段 DNA 的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合 RNA 聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。 参与 RNA-pol
14、转录的 TF -TFD、 TFA、TFB、TFF、TFE、TFH（3）转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC) 真核生物 RNA-pol 不与 DNA 分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。 （4）模板理论(piecing theory) 一个真核生物基因的转录需要 3 至 5 个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性、有专一性的复合物，再与 RNA 聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 2. 转录延伸真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol 前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到
15、核小体移位和解聚现象。 3. 转录终止 和转录后修饰密切相关。四、转录后加工5端加帽、3 端加尾、RNA 的剪接、RNA 的编辑1、在 5端加帽5端的一个核苷酸总是 7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp） 。mRNA5端的这种结构称为帽子（cap） 。6帽子结构功能：能被核糖体小亚基识别，促使 mRNA 和核糖体的结合；m7Gppp 结构能有效地封闭 mRNA 5末端，以保护 mRNA 免受 5核酸外切酶的降解，增强 mRNA 的稳定。2、3端加尾-多聚腺苷酸尾巴-AAUAAA ：准确切割。 。加 poly（A）多聚腺苷酸尾巴功能：提高了 mRNA 在细胞质中的稳定性。3、RNA 的剪接生物体内
16、内含子的主要类型：U-AG、AU-AC、类内含子、类内含子类内含子参与 RNA 剪接的物质： snRNA（核内小分子 RNA） 、snRNP（与 snRNA 结合的核蛋白） 、核内 RNA（U1、U2、 U4、U5、U6 ）4、RNA 的编辑* 编辑（editing）是指转录后的 RNA 在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。五、原核生物与真核生物 mRNA 的特征比较1、原核生物 mRNA 的特征 半衰期短 多以多顺反子的形式存在 单顺反子 mRNA：只编码一个蛋白质的 mRNA。多顺反子 mRNA：编码多个蛋白质的 mRNA。Z： -半乳糖苷酶 Y： 透过酶 A：乙酰基转移酶ZYA 为
17、结构基因 5 端无“帽子”结构， 3 端没有或只有较短的 poly（A ）结构。 SD 序列：原核生物起始密码子 AUG 上游 7-12 个核苷酸处有一被称为 SD 序列的保守区。mRNA 中用于结合原核生物核糖体的序列。 P85 2、真核生物 mRNA 的特征“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能 RNA 所必需的全部核甘酸序列。 5 端存在“帽子”结构多数 mRNA 3 端具有 poly（A ）尾巴（组蛋白除外）以单顺反子的形式存在六、RNA 合成与 DNA 合成异同点相同点：1、都以 DNA 链作为模板2、合成的方向均为 53 3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的 3,5-磷酸二
18、酯键，使核苷酸链延长。不同点：复制 转录7模板 两条链均复制 模板链转录（不对称转录）原料 dNTP NTP酶 DNA 聚合酶 RNA 聚合酶产物 子代双链 DNA（半保留复制）mRNA， tRNA， rRNA配对 A-T；G-C A-U；T-A；G-C引物 RNA 引物 无第四章 生物信息的传递（下） 从 mRNA 到蛋白质翻译：指将 mRNA 链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。蛋白质合成的场所是核糖体。蛋白质合成的模板是 mRNA模板与氨基酸之间的接合体是 tRNA蛋白质合成的原料是 20 种氨基酸一、遗传密码 三联子（一）
19、三联子密码：mRNA 链上每三个核甘酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核甘酸就称为密码子或三联子密码(triplet coden) 。至 1966 年，20 种氨基酸对应的 61 个密码子和三个终止密码子全部被查清。（三）遗传密码的性质1、 连续性编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。 基因损伤引起 mRNA 阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。 从 mRNA 5端起始密码子 AUG 到 3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架(open read
20、ing frame, ORF)。 2、简并性由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy） ，对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon） 。3、通用性与特殊性蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。4、摆动性转运氨基酸的 tRNA 上的反密码子需要通过碱基互补与 mRNA 上的遗传密码子反向配对结合，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动” ，这种现象称为密码子的摆动性。 二、tRNA 的结构、功能与种类8（一） tRNA
21、 的结构1、二级结构：三叶草形 2、三级结构： “L”形（二） tRNA 的功能1、解读 mRNA 的遗传信息2、运输的工具，运载氨基酸tRNA 有两个关键部位： 3端 CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。与 mRNA 结合部位反密码子部位tRNA 凭借自身的反密码子与 mRNA 链上的密码子相识别，把所带氨基酸放到肽链的一定位置。1、起始 tRNA 和延伸 tRNA能特异地识别 mRNA 模板上起始密码子的 tRNA 称起始 tRNA，其他 tRNA 统称为延伸 tRNA。真核生物：起始密码子 AUG 所编码的氨基酸是 Met，起始 AA-tRNA 为 Met-tRNAMet。原核生物：
22、起始密码子 AUG 所编码的氨基酸并不是 甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸，起始 AA-tRNA 为 fMet-tRNAfMet2、同工 tRNA代表同一种氨基酸的 tRNA 称为同工 tRNA。同工 tRNA 既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA 合成酶识别（P119） 。3、校正 tRNA无义突变校正 tRNA：可以通过改变反密码子区校正无义突变错义突变校正 tRNA：通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（U
23、AG、UGA、UAA） ，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。 错义突变：由于结构基因中某个核甘酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子，这种基因突变叫错义突变。GGA（甘氨酸） AGA（精氨酸）四、氨酰-tRNA 合成酶 AA- tRNA 合成酶是一类催化氨基酸与 tRNA 结合的特异性酶，它既能识别tRNA，又能识别氨基酸，对两者都具有高度的专一性。三、核糖体的结构与功能 核糖体是由 rRNA（ribosomal ribonucleic acid）和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的。细菌是
24、 70s50s30s 哺乳动物是 80s60s40s（二）核糖体的功能：合成蛋白质9在单个核糖体上，可化分多个功能活性中心，在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能。mRNA 结合部位小亚基结合或接受 AA-tRNA 部位（A 位）大亚基结合或接受肽基 tRNA 的部位大亚基肽基转移部位（P 位）大亚基形成肽键的部位（转肽酶中心）大亚基 四、蛋白质合成的过程(生物学机制） 氨基酸的活化 翻译的起始 肽链的延伸 肽链的终止 蛋白质前体的加工(一) 氨基酸的活化原核生物中，起始氨基酸是：甲酰甲硫氨酸起始 AA-tRNA 是：fMet-tRNAfMet真核生物中，起始氨基酸是：甲硫氨酸起始 AA-
25、tRNA 是：Met-tRNAMet(二) 翻译的起始原核生物（细菌）为例：所需成分：30S 小亚基、 50S 大亚基、模板 mRNA、 fMet-tRNAfMet、GTP 、Mg2+翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3 、翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成 3 步： （P129）1. 核蛋白体大小亚基分离2、30S 小亚基通过 SD 序列与 mRNA 模板相结合。3.在 IF-2 和 GTP 的帮助下， fMet-tRNAfMet 进入小亚基的 P 位，tRNA 上的反密码子与 mRNA 上的起始密码子配对。4、带有 tRNA、mRNA 和 3 个翻译起始因子的小亚基复合物与 5
26、0S 大亚基结合，GTP 水解，释放翻译起始因子。真核生物翻译起始的特点核糖体较大,为 80；起始因子比较多；10 mRNA 5端具有 m7Gppp 帽子结构 Met-tRNAMet mRNA 的 5端帽子结构和 3端 polyA 都参与形成翻译起始复合物； 真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物)原核生物中 30S 小亚基首先与 mRNA 模板相结合，再与 fMet-tRNAfMet 结合，最后与 50S 大亚基结合。而在真核生物中，40S 小亚基首先与 Met-tRNAMet 相结合，再与模板 mRNA 结合，最后与 60S 大亚基结合生成 80SmRNAMet-tRNAMet 起始复合
27、物（P131） 。(三) 肽链的延伸肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括：AA-tRNA 与核糖体结合、肽键的生成和移位。延伸因子(elongation factor, EF) ： 原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts)、 EF-G真核生物：EF-1 、EF-2 1、AA-tRNA 与核糖体 A 位点的结合需要消耗 GTP，并需 EF-Tu、EF-Ts 两种延伸因子2、肽键形成：是由转肽酶/肽基转移酶催化3、移位：核糖体向 mRNA3端方向移动一个密码子。需要消耗 GTP，并需 EF-G 延伸因子A 位点是新到来的氨酰-tRNA 的结合位点。P 位点是肽酰
28、- tRNA 的结合位点。E 位点是延伸过程中释放 tRNA 的位点，即，去氨酰-tRNA 通过 E 位点脱出，释放到核糖体外的胞质中。（四）肽链的终止RF1：识别终止密码子 UAA 和 UAG终止因子 RF2：识别终止密码子 UAA 和 UGARF3：具 GTP 酶活性，刺激 RF1 和 RF2 活性，协助肽链的释放真核生物只有一个终止因子（eRF）(五) 蛋白质前体的加工1、N 端 fMet 或 Met 的切除2、二硫键的形成3、特定氨基酸的修饰磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化4、切除新生肽链中非功能片段（六）蛋白质折叠由核糖体合成的所有新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力
29、学和热力学稳定的三位构象，从而表现出生物学活性或功能。新生多肽一级结构二级结构三级结构已经具有活性（对于寡聚蛋白需要组装称为四级结构才有活性。11(七) 蛋白质合成抑制剂 青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。被广泛用于人类医学。 氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。氯霉素有时也用于治病，但剂量和周期受到较严控制。五、蛋白质的运转机制1、翻译-运转同步机制2、翻译后运转机制(1)线粒体蛋白质跨膜运转(2)叶绿体蛋白质的跨膜运转3、核定位蛋白的运转机制4、蛋白质的降解*蛋白
30、质的合成位点与功能位点常常被细胞内的膜所隔开，蛋白质需要运转。*核糖体是真核生物细胞内合成蛋白质的场所，任何时候都有许多蛋白质被输送到细胞质、细胞核、线粒体和内质网等各个部分，补充和更新细胞功能。*细胞各部分都有特定的蛋白质组分，蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。 *细胞中蛋白质的合成：绝大多数在细胞质中合成；一小部分在细胞器（叶绿体和线粒体）中合成。*定位于细胞器内的大部分蛋白质在细胞质中合成，细胞器内合成的留在细胞器内。*蛋白质插入或穿过生物膜的过程称为蛋白质运转（protein translocation） 。蛋白质运转的两种方式翻译-运转同步（co-transla
31、tional translocation）是即将进入内质网的蛋白质的易位方式；蛋白质正合成的时候就可与运转装置结合； 蛋白质合成时，核糖体定位于内质网表面，称膜结合核糖体(membrane-bound ribosome） 。分泌蛋白质大多是以同步机制运输的翻译后运转（post-translational translocation）蛋白质翻译完成后从核糖体上释放，然合扩散至合适的靶膜并与运转装置结合。蛋白质合成时，其核糖体不与任何细胞器相连，称游离核糖体(free ribosome)在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。参与生物膜形成的蛋白质，依赖于上述两
32、种不同的运转机制镶入膜内。蛋白性质 运转机制 主要类型 分泌 蛋白质在结合核糖体上合成，并免疫球蛋白、卵蛋白、12以翻译-运转同步机制运输水解酶、激素等细胞器发育 蛋白质在游离核糖体上合成，以翻译后运转机制运输 核、叶绿体、线粒体、乙醛酸循环体、过氧化物酶体等细胞器中的蛋白质 膜的形成 两种机制兼有 质膜、内质网、类囊体中的蛋白质 1、翻译-运转同步机制信号肽假说信号肽：能启动蛋白质运转的任何一段多肽。 （常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的 N-末端氨基酸序列（有时不一定在 N 端） ） 。绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽。信号序列特点：（1）一般带有 10-15 个疏
33、水氨基酸；（2）在靠近该序列 N-端常常有 1 个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其 C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸） 。信号肽假说内容：（1）蛋白质合成起始首先合成信号肽（2）SRP （信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停（3）SRP 与 SRP 受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始（4）信号肽进入膜结构（5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行（6）蛋白质完全过膜，核糖体解离信号肽与蛋白质转运的关系 P144（1）完整信号肽是保证蛋白质转运的必要条件；（2）仅有信号肽不足以保证蛋白质转运发生；（3）信号序
34、列切除并不是转运所必需；（4）并非所有运转蛋白质都有可降解的信号肽。蛋白质翻译运转同步运输的基本过程 可分两个阶段：首先：带有新生肽链的核糖体与膜结合；然后：新生肽链进入膜通道并易位。核糖体与膜结合需要信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP） 。SRP 有两种能力：13结合新合成的分泌型蛋白的信号序列；结合位于膜上的 SRP 受体。2、翻译后运转机制前导肽及其特性: 翻译后跨膜易位的蛋白质，前体一般含前导肽(leader peptide)，前导肽在跨膜运转中起重要作用。 过膜后，前导肽水解，蛋白质变为有功能的蛋白质。前导肽的一般特性：（1）带正电荷碱性氨
35、基酸（Arg）较丰富， 分散于不带电荷的氨基酸序列之间；（2）缺少带负电荷的酸性氨基酸；（3）羟基氨基酸（Ser）含量较高；（4）有形成两亲（亲水和疏水）- 螺旋能力。线粒体蛋白质跨膜运转 Hsp70 为分子伴侣 分子伴侣：结合在一些不完全装配或不恰当折叠蛋白上，帮助它们折叠或防止它们聚集的蛋白质。 分子伴侣的生物学功能 (1)帮助新生蛋白质正确折叠 (2)纠正错误折叠或介导其降解 泛素活化酶 (ubiquitin - activating enzyme，E1) 泛素结合酶（ubiquitin - conjugating enzyme，E2) 泛素蛋白连接酶(ubiquitin -protei
36、nligating enzyme, E3)E1,E2,E3 的作用： E1 激活泛素分子， E2 就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。 E3 能识别被降解的蛋白质。第五章 分子生物学研究法重组 DNA 技术- 基因工程 分子杂交及相关技术聚合酶链式反应的原理和应用DNA 多态性及其检测 基因操作：主要包括 DNA 分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和 PCR 扩增等。 基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一
37、部分。1、理论上的三大发现 遗传物质主要是 DNA14 DNA 的双螺旋结构和半保留复制机制 遗传密码子的破译2、技术上的三大发明 限制酶和连接酶体外切割和连接 DNA 片断 质粒改造成载体以携带 DNA 片断克隆 逆转录酶的使用常用的工具酶限制性核酸内切酶 切割 DNADNA 连接酶 生成 3- 5磷酸二酯键DNA 聚合酶 探针标记、补平 3末端反转录酶 cDNA 合成多聚核苷酸激酶 5磷酸化、探针标记末端转移酶 3末端多聚尾碱性磷酸酶 切除末端磷酸基载体 vector 自我复制 克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC）噬菌体（，M13）真核载体：动物病毒载体 pLXSN载体
38、的条件 分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的 copy 数 带筛选的标志1982 年 - 转基因小鼠1997 年 克隆绵羊“多利”1998 年 - 克隆鼠2001 年 2 月 - 人类基因组重组 DNA 技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。重组 DNA 技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA 片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。 基
39、因操作：主要包括 DNA 分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和 PCR 扩增等。基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。15基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。或者说基因操作技术服务于基因工程。一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA 链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”） 。发现于原核生物体内，现已分离出 100 多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 D
40、NA 技术和基因诊断中重要的一类工具酶。1、限制酶的命名 命名原则：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。如：属名 菌株名E co R I种名 编号EcoRI 来源于大肠杆菌 E.coli 的 RY13 菌株,I 指在该菌株中分离的第一个限制酶。2、限制酶的特点： （1）. 限制性内切酶一般识别完全的回文结构，它具有两个基本特点： 能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对； 两条互补链的 53的序列组成相同，即将一条链旋转 180 度，则两条链重叠。（2）. 识别-8 个相连的核苷酸组成的特定核甘酸序列。（3） 切割方式有两种 错位切割，产生互补性的粘性末端。错位切割所产
41、生的 DNA 末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的 DNA 分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。 沿对称轴切割，产生平齐末端切割后，DNA 末端的一条链多出一至几个核苷酸，成为突出末端，又称粘性末端包括 3突出、5 突出。切割两条链时产生两端平整的 DNA 分子，称为平末端。（4） 具有同裂酶来源不同的限制性内切酶识别同样的核甘酸靶序列。如：BamH I 和 Bst I 具有相同的识别序列 GGATCC。（5） 具有同尾酶来源各异，识别的靶序列也不同，但却产生相同的黏性末端，故同尾酶产生的黏性末端可以连接起来，但一般不能再被原来的任何一
42、种酶所切割。如：Taq I、Cla I 和 Acc I 为一组同尾酶，其中任何一种酶切割 DNA 分子都产生 5端 CG 凸出的粘性末端。二、目的基因及载体（一）目的基因（一）目的基因的获得161）化学合成法：较短的基因（60-80bp ）用途：PCR 引物、测序引物、定点突变、核酸杂交探针1）DNA 的化学合成 单链 DNA 短片段的合成已成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术。 化学合成 DNA 分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到 DNA 双链的 5端，而在细胞中 DNA 分子合成的方向恰恰相反。 整个 DNA 的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行，并且可以对合成过程进行计算机控制。 目
43、前常用的化学合成 DNA 的方法是磷酰胺法。2）基因组文库和 cDNA 文库基因库，也叫基因组文库， DNA 文库（ DNA library) 是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。将生物细胞基因组 DNA 通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组 DNA 片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组 DNA 的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的“图书馆”中查找（没有目录） 。cDNA 文库 首先获得 mRNA，反转录得 cDNA，经克隆后形成文库。cDAN 文库和基因组文库的不同之处在于， cDNA
44、 文库除却了 mRNA 拼接过程中除去的内含子等成分，便于 DNA 重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的 cDNA 分子的核酸序列直接推倒出来。组建一个 cDNA 文库的步骤：1)分离表达目的基因的组织或细胞2)从组织或细胞中制备总体 RNA 和 mRNA3）第一条 cDNA 链的合成，需要 RNA 模板，cDNA 合成引物，逆转录酶，4 种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+) 等。4)第二条 cDNA 链的合成5) cDNA 的甲基化和接头的加入6)双链 cDNA 与载体的连接（二）载体载体（Vector）: 将外源目的 DNA 导入受体细
45、胞，并能自我复制和增殖的工具。载体具以下特征：1)分子量小，便于携带较大的 DNA 片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；（质粒大于 15kb 时，其将外源 DNA 转入大肠杆菌的效率将大大降低。 ）2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；3)被切割后的载体，插入外源 DNA 后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因） 。174）可以在载体细胞中独立复制，即本身是一个复制子。基因工程载体的分类根据载体的分子生物学特性划分（1）. 质粒型载体环状 dsDNA 分子，自主复制（质粒 DNA 载体） 。如：质粒载体（2）. 病毒型载体环状、线状、ss-和 ds-DNA 分子，形
46、成病毒颗粒。如：噬菌体载体（3）.混合型载体具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性。如：柯斯质粒载体 用于原核生物宿主的载体目前已构建应用的基因工程载体主要有：质粒载体、 噬菌体载体、 柯斯质粒载体。（一）.质粒（plasmid ）：质粒是细胞染色体或核区 DNA 外能够自主复制的很 质粒载体特点1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2、 至少应有一个克隆位点，以供外源 DNA 插入。3、 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组 DNA 分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。注：前三个特点必不可少。1、 标记基因的作用1）指示外源 D
47、NA 分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2）指示外源 DNA 分子是否插入载体分子形成了重组子。2、 标记基因的种类1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr2）生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如 lacZ3、常用的遗传标记基因及其作用机制1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） 2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr）3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr ）4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和 G418 抗性(G418r)基因5）半乳糖苷酶基因（lacZ 和 lacZ ） 三
48、 DNA 重组基本程序1.分载体和目的基因的分离2.切限制性内切酶的应用3.接载体与目的基因连接成重组体4.转基因序列转入细胞5.筛目的基因序列克隆的筛选和鉴定6.表目的基因在宿主细胞的表达目的基因的获取方法：从基因组中提取、CDNA 法、化学合成法、PCR 法。18鉴定得到的目的基因的鉴定方法：抗性选择、提取质粒电泳鉴定大小、快速提取酶切鉴定、菌落杂交法、DNA 序列分析。第二节 分子杂交及相关技术 分子杂交： 是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程.分子杂交包括：DNA-DNA 杂交（原位杂交、点杂交、Southern 杂交） ，DNA-RNA 杂交（Northern 杂交）及蛋白杂交（ Western 杂交）等。 一、杂交探针（Probe ）的获得 Probe：探针，是由放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记后，能与目的基因片段特异性杂交的已知序列的核酸片段。根据探针的来源及核酸性质不同又可分为 DNA 探针，RNA 探针，cDNA 探针，及寡核苷酸探针等几类。 DNA 探针：DNA 探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链 DNA 或单链DNA。这
