1、分子生物学整理2013/12/10根据每份 PPT 后的老师给的题目整理的，据说考试不超过那个范围，大家认真复习，若有错误的地方，请积极批评指正！第一份 PPT1. 分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上正式揭示生物界的奥秘，有被动地适应自然界转为主动地改造和重组自然界的基础学科。2. 生物大分子（ biomacromolecule ）：主要包括核酸（ DNA 和 RNA） 、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相关。 3.
2、DNA 重组技术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。4. 结构分子生物学：研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的学科。5. 基因组（Genome）：是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部 DNA分子的总和。6. 基因组计划（ genome project）：以获得某物种基因组全序列为主要目标的科学计划。7. 基因组学（genomics）：是指研究基因组结构和功能的科学，包括基因组作图、核苷酸序列测定、基因定位及基因功能分析等。8. 结构基因组学（structural genomics）：以全基因组
3、测序为目标，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。9. 功能基因组学（functional genomics）：以基因功能鉴定为目标，根据结构基因组学提供的信息，以高通量、大规模的实验方法，借助计算机分析，系统地对基因功能进行诠释。10.生物信息学是以生物大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。1. 什么是分子生物学？其研究对象是什么？分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主
4、动地改造和重组自然界的基础学科。 研究对象：生物大分子（ biomacromolecule ）：主要包括核酸（DNA 和 RNA） 、蛋白质、多糖等，其主要特征是由小分子的构件分子（如：核苷酸、氨基酸、单糖等）组成，具有较复杂的空间结构，而且空间结构与其生物活性密切相关。2. 试举出 5 例分子生物学发展史上的重要科学事件 Charles Darwin 进化论：物竞天择，适者生存 施旺细胞学说：动植物都是由细胞组成的。 Gregor Mendel 经典遗传学：遗传因子 Morgan 基因学说 Watson 和 CrickDNA 双螺旋模型：里程碑3. 什么是 DNA 重组技术？有何应用？DNA
5、 重组技术（又称基因工程）是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。应用： 基础理论研究中的应用基因组测序基因定位基因功能研究基因表达和调控研究 多肽类（如激素、抗生素、酶类和抗体等）产品的生产微生物基因工程与多肽类产品的生产转基因动物与蛋白药物的生产转基因植物与蛋白药物的生产 转基因动物与人类器官移植 物种改良转基因动植物、工程微生物4. 什么是结构分子生物学？结构分子生物学是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。内容：结构测定、结构运动变化规律探索、结构与功能关系手段：X- 射线衍射晶体学（蛋白质晶体学） 、二维或多维核
6、磁共振研究液相结构、电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法。第二份 PPT 分子生物学研究法核酸：是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础(包括 DNA 与 RNA)SDS 裂解法：将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和 EDTA 处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用 SDS 裂解，从而温和地释放质粒 DNA 到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒 DNA。荧光光度法：用 EB 等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA 分子较RNA 大得多，电泳迁移率低。紫外分光光度法：该法主要通过 A260 与 A280 的比值来判定有无蛋白质的污染。在 TE 缓冲液中，纯
7、 DNA 的 A260/A280 为 1.8，纯 RNA 的比值为 2.0。比值升高与降低均提示不纯。玻棒缠绕法：两个关键步骤，一是基因组 DNA 沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA 沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段 DNA 从无水乙醇中转移至 pH8.0 的 TE缓冲液中。压碎与浸泡法：将含待回收 DNA 条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱 缓冲液浸泡，使 DNA 洗脱出来。碱裂解法：在 NaOH 提供的高 pH（12.012.6）条件下，用强阳离子去垢剂 SDS 破坏细胞壁，裂解细胞，与 NaOH 共同使宿主细胞的蛋白质与染色体 DNA 发生变性，释放出质
8、粒DNA。 （尽 管碱溶液能破坏 DNA 中的碱基配对，但 CCC 质粒 DNA 因缠绕紧密而不易解链，只要不在 碱性条件下变性太久，当 pH 调至中性时，CCC 质粒 DNA 就可重新恢复天然的超螺旋。 ）酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法：以含 4mmol/L 的异硫氰酸胍与 0.1mmol/L 的 -巯基乙醇 的变性溶液裂解细胞，然后在 pH4.0 的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与 75%的乙醇洗涤来制备 RNA。变性 ：在某些理化因素的作用下，维系 DNA 分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA 由双螺旋变成单链过程。增色效应：DNA 变性时其溶液 OD2
9、60增高的现象。融解温度（T m）：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的 50%时的温度称为 DNA 的解链温 度或融解温度。 （爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到 熔点时的融化现象，故名融解温度。狭窄性：变性温度范围很小。 ）复性：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。退火：热变性 DNA 一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火” 。核酸分子杂交:两条 DNA 链或两条 RNA 链或一条 DNA 链和一条 RNA 链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。 （杂交的本质：
10、就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。 ）核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后 可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。cDNA(complementary DNA)：是指与 mRNA 互补的 DNA 分子。固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的 杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交 并对其检测的方法基因芯片(gene chip)：又称 DNA 芯片（DNA chip）或 DNA 微阵列（DNA microarray） ，是
11、指 集成了大量 DNA 片段的玻璃片或纤维膜等载体。问答：1、简述核酸纯化的原则和要求。原则：保持核酸碱基序列的完整性。尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度要求：在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。1、温度不要过高(0-4) (高温破坏氢键) ；2、控制 pH 值范围(pH4-10) (极端酸碱破坏磷酸二酯键) ；3、减少物理因素对核酸的机械剪切力；4、保持一定离子强度。核酸纯度的要求1、核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂； 2、其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度； 3、排除其它核酸分子的污染，如提取 DNA 分子时应去除
12、 RNA，提取 RNA 分子时应 去除 DNA。2、说明核酸凝胶电泳技术的原理和要点。原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，带负电荷，在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此，迁移率与核酸分子大小成反比。要点：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。电泳鉴定方法：荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基
13、平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出红色荧光。3、为何沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法？改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。4、简述核酸鉴定的要点。1、核酸浓度鉴定紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外 线，其最大吸收波长为 260nm。荧光光度法：核酸在嵌入 EB 后，发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的 含量呈正比。2、核酸纯度鉴定紫外分光光度法：该法主要通过 A260 与 A280 的比值来判定有无蛋白质的污染。在 TE 缓冲液中，纯 DNA 的 A260/A280 为 1.8，纯 RNA 的比值为
14、2.0。比值升高与降低均提示 不纯。荧光光度法：用 EB 等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA 分子 较 RNA 大得多，电泳迁移率低核酸纯度鉴定3、完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳法：以 EB 为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。A、基因组 DNA 片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。B、完整的或降解很少的总 RNA 电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值， 如有改变则提示有 RNA 的降解。C、若在点样孔附近有着色条带，则说明存在 DNA 的污染。5、什么是酚抽提法？什么是碱裂解法？酚抽提法：以含 EDTA、SDS 及无 DNA 酶的 RNA 酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶
15、K 处理 后，用 pH8.0 的 Tris 饱和酚抽提 DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的 DNA 样品。裂解液成分的作用：EDTA：离子螯合剂，抑制 DNase 活性，降低细胞膜稳定性。SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase。无 DNase 的 RNase：可高效水解 RNA 而避免 DNA 的消化。蛋白酶 K：消化 DNase 和胞中的蛋白质。酚：变性沉淀蛋白，抑制 DNase 活性。pH 8.0 的 Tris 缓冲液：保证抽提时 DNA 进入水相，防止 DNA 变性。碱裂解法：在 NaOH 提供的高 pH（12.0
16、12.6）条件下，用强阳离子去垢剂 SDS 破坏细胞壁，裂解细胞，与 NaOH 共同使宿主细胞的蛋白质与染色体 DNA 发生变性，释放出质粒 DNA6、简述 RNA 提取的要点。RNA 极易被 RNase 水解，除胞内的 RNase 外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase 分子很难失去活性，而且容易复性，在 RNA 的制备过程中，排除RNase 的污染及强有力地抑制其活性是 RNA 制备成功与否的关键。酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步分离总 RNA它以含异硫氰酸胍，-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞，然后在 pH4.0的条件下，用酚/氯仿抽提细胞裂解溶液，最后
17、通过异丙醇沉淀与 75%的乙醇洗涤而获得总RNA7、什么核酸变性、核酸复性和融解温度？分别受哪些因素影响？核酸变性：在某些理化因素的作用下，维系 DNA 分子二级结构的氢键和碱基堆积力受 到破坏，DNA 由双螺旋变成单链过程影响因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。如：加热，极端的pH有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）核酸复性：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构 的现象，它是变性的一种逆转过程。影响因素：1、温度和时间 2、DNA 浓度 3、DNA 分子大小和复杂度 4、离子强度融解温度：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的 50%时的
18、温度称为 DNA 的解链 温度或融解温度。影响因素：1、DNA 分子大小和碱基的组成 2、溶液的离子强度 3、pH 值 4、变性剂8、什么是核酸分子杂交？其本质是什么？核酸分子杂交：两条 DNA 链或两条 RNA 链或一条 DNA 链和一条 RNA 链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。本质：在一定条件下使互补核酸链实现复性。 9、什么是核酸探针？有哪些类型？其设计需要遵循哪些原则？核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的 已知被标记的核酸分子。类型：基因组 DNA 探针 cDNA 探针 RNA 探针 寡核苷酸探针探针设计原则：1
19、、探针长度：一般要求在 1050bp。 2、 GC 含量为 4060。 3、 探针分子中应避免互补序列。 4、避免同一碱基连续出现，一般不能多于 4 个，如 GGGG-或 -CCCC-。 5、借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较。10、理想的探针标记物应具有什么特点？检测物要灵敏、特异、稳定、简便。标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂 交特异性、稳定性和 Tm 值。标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。标记物对检测方法无干扰。11、简述核酸分子杂交技术的一般流程。探针制备及标记（同位素或非同位素） 待测核酸样品制备（分离，纯化）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交后
20、处理（去掉非特异杂交分子）显示结果（显色，发光，放射自显影）结果分析12、有哪些常用的核酸分子杂交技术？其检测对象分别是什么？13、什么是固相分子杂交？其优点是什么？是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。优点：未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止 靶 DNA 的自我复性，所以被广泛应用。14、请比较 Southern 印迹杂交和 Northern 印迹杂交的相同点和不同点。相同点：杂交流程相同，探针种类和标记方法相同，检测方法相同不同点：Southern 印迹是与酶切后的
21、电泳 DNA 片段杂交，Northern 印迹杂交是应用DNA 探针检测特异 mRNA 的一种膜上印迹技术。15、什么是原位杂交？其特点是什么？原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进 行杂交并对其检测的方法。特点：原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并可精确定位，16、如何进行核酸分子杂交条件的优化？1、探针的选择检测单个碱基改变选用寡核苷酸探针。检测单链靶序列选用与其互补的 DNA 单链探针或 RNA 探针。长的双链 DNA 探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体。100bp 左右的探针适合原位杂交。2、探针的标记方法在检测单
22、拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的 HRP 显示系统等 。3、探针的浓度随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加4、杂交最适温度若反应温度低于 Tm 1015，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配 对减少。一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在 65进行，当含 50%甲酰 胺时，在 42进行。5、反应时间和洗膜温度杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交 20 h 左右。杂交后的最终洗膜温度一般应低于 Tm 值 512进行 。17、什么是
23、基因芯片？其突出特点是什么？有何应用？ 基因芯片(gene chip)：又称 DNA 芯片（DNA chip）或 DNA 微阵列（DNA microarray） ，是指集成了大量 DNA 片段的玻璃片或纤维膜等载体。突出特点：建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段应用：基因表达水平的检测基因突变和多态性的检测 基因芯片在药物筛选中的应用预防医学领域的应用 基因芯片在疾病诊断中的应用第三份 PPT名词解释：one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、Taq DNA 聚合酶、PCR 引物、dNTP 和缓冲液，直接以 mRNA 为模板进行逆转录和
24、PCR 扩增，称为一步法 RT-PCR荧光定量 PCR：是通过对 PCR 扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测，对起始模板进行定量分析的技术。实时荧光定量 PCR:是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光阈值：CR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 Ct 值： C 代表 Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。PCR-限制性酶切片段多态性（
25、PCR-RFLP ）：不同的限制性核酸内切酶能识别特异的DNA 序 列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的 DNA 分子进行消化，得到的酶切片段其大 小和数量可以在一定程度上反应出目的 DNA 分子的序列信息。 （用途：传染病病原体 基因分型、人类基因变异研究。 ）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）：本法就是将 PCR 产物双链 DNA（dsDNA）变性为 单链 DNA （ssDNA） ，加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于 DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与 ssDNA 序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA 带位置的差异即可反映出 PCR 产物
26、序列的差异。PCR-ELISA：引物采用双标记，即一个引物 5端标记便于 PCR 产物固定的功能基团（如生 物素） ，另一个引物 5端标记便于 PCR 产物检测的基团（如地高辛、荧光素等） 。非特异性扩增：PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。荧光染料法：SYBR 荧光染料能特异性地掺入 DNA 双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。复合探针法（complex probes）基本原理：首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp） ，5端 接一荧光分子
27、，另一为淬灭探针（15bp） ，3端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5端杂交。问答:1、简述聚合酶链反应（PCR）的原理和反应体系。原理：模拟体内 DNA 半保留复制过程，在模板 DNA、引物和四种 dNTP 存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。反应体系：模板（template）引物（primer） DNA 聚合酶（DNA polymerase）dNTPPCR buffer 2、PCR 引物的设计需要遵循哪些原则？1、长度 1530 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。2、引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G
28、+C 含量宜在 45 55%左右。3、引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；两个引物之间尤其在 3 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体4、物的碱基顺序与非扩增区域同源性小于 70%或连续互补碱基少于 8 个。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。5、引物的 3末端与模板 DNA 一定要配对。另外 3末端的末位碱基最好选 T、G、C，而不选 A（引物 3末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异） 。6、只要与模板 DNA 结合的引物长度足够，引物的 5 末端碱基最多可以有 10 个碱基不与模板 DNA 匹配，并不影响 PCR 反应进行。 3、简述 PCR
29、 的一般方案。1、50 ul PCR 反应体系的组成样品 DNA 0.11ug；正链引物（25umol/L）1.0ul ；负链引物（25umol/L）1.0ul ；dNTP （各 2.5mmol/L）4.0ul；10PCR 缓冲液 5.0ul；MgCl2（25mmol/L ）3.0ul ；Taq DNA 聚合酶 1 2.5u；蒸馏的去离子水补至 50ul。2、对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板 DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。3、PCR 仪工作参数的设置： 94 3060sec ，553060sec，723060sec ，循环 30 次，最后 72延伸 5min。4、PCR 产物的保
30、存：PCR 产物于 4保存。4、请分别说明假阳性、非特异性扩增、假阴性、引物二聚体、无扩增产物、拖尾等现象出现的原因及应采取的对策。假阳性原因：PCR 产物是最主要的污染源。含有靶 DNA 序列的质粒的污染。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。在采集标本时，其他污染源带来的污染。Taq 聚合酶中带有细菌 DNA，当 PCR 扩增片段为保守的 rRNA 序列时,易造成假阳性 对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及 加样枪头等均应一次性使用。3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。非特异性扩增原因
31、：1、引物特异性差 2、模板或引物浓度过高 3、酶量过多 4、Mg2+ 浓度偏高 5、退火温度偏低 6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式 PCR 2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量 4、降低镁离子浓度 5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6、减少循环次数 假阴性原因：1、标本处理的原因处理标本时，靶 DNA 丢失。处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入 PCR 反应中抑制了 Taq 酶活性。标本放置不当，模板发生降解（尤其是 RNA）2）PCR 试剂问题Taq DNA 聚合酶失活。 Mg2+浓度过低或是没有加。3）PCR 扩增过程中的问题PCR 扩增仪故障。 PCR
32、扩增反应液没有加液体石蜡油。4）PCR 产物鉴定中的问题电泳时没有加溴化乙锭。电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。凝胶浓度过低，使扩增带跑散。对策：依原因，自己总结引物二聚体的原因有：1、两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是 引物 3端有互补区。2、引物模板比例太高，可增加模板用量。3、退火温度过低。4、热循环次数过多。对策：增加模板用量。提高退火温度。减少热循环次数。减少引物 3端有互补区碱基配对无扩增产物的原因：模板含有抑制物，含量低。Buffer 对样品不合适。引物设计不当或者发生降解。退火温度太高，延伸时间太短。对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量
33、。更换 Buffer 或调整浓度。降低退火温度、延长延伸时间。重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。拖尾产生原因：模板不纯、Buffer 不合适、退火温度偏低、酶量过多、dNTP、Mg2+浓度偏高、循环次数过多对策：纯化模板、更换 Buffer、适当提高退火温度、适量用酶适当降低 dNTP 和镁离子的浓度、减少循环次数5、简述荧光定量 PCR 的原理和定量方法。原理：基于荧光能量传递技术，通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色基团转移到受体发色团，转移效率与两个发色团之间距离的 6 次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与 DNA 产量成正比，检
34、测 PCR 过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。定量方法： 荧光染料法，荧光探针法6、荧光定量 PCR 有哪些类型？荧光染料法、荧光探针法、Taqman 技术、LightCycler 探针技术、molecular Beacon技 术、复合探针法名词解释：基因工程:是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。分子克隆：是指将目的 DNA 片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该 DNA 分子大量拷贝的技术限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链 DNA 特定核苷酸序列的核酸水解酶。回文结构：指双链 DNA 分子上按对称轴排列的反向
35、互补序列（常为限制酶所识别） 。粘性末端：指限制酶错位切开两条对称轴互补 DNA 双链所产生的末端。平末端：指限制酶平齐切开两条对称轴互补 DNA 双链所产生的末端。同工异源酶：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。 同尾酶：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。载体：指能携带外源 DNA 片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。克隆载体：能将载体外源 DNA 在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的 DNA 的载体多克隆位点：载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点表达载体：指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水
36、平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因基因组文库：是指含有某种生物全部基因随机片段的重组 DNA 克隆群感受态细胞：细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源 DNA 能力的细胞转化：是指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程问答：1、Klenow 片段、Taq 酶、逆转录酶、末端转移酶和 DNA 连接酶分别有哪些作用？Klenow 片段：补齐双链 DNA 的 3 末端，同时可使 3 末端 DNA 标记上同位素。cDNA 克隆中，合成 cDNA 第二链。DNA 序列分析。Taq 酶：具有 5 3 聚合酶活性和依赖于聚合作用的 5 3 外切酶活性。可用于DNA 测序及通过聚合
37、酶链反应（PCR）对 DNA 分子的特定序列进行体外扩增。逆转录酶：依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，它以 RNA 为模板，4 种 dNTP 为底物，催化合成DNA，逆转录酶是多功能酶。 RNA 指导的 DNA 聚合酶活性（ RDDP） 核糖核酸酶 H 活性（RNaseH） DNA 聚合酶活性（DDDP ）末端转移酶：在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链 DNA 分子 的 3 末端-OH 上。 功能主要有：1、在载体或目的基因 3 末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于 DNA 重组连接。2、用于 DNA 3 末端的同位素探针标记。DNA 连接酶：催化两个互补粘性末
38、端或平末端双链 DNA 分子的 5 磷酸基团与 3羟 基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的 DNA 连接起来2、克隆载体应具备什么特征？能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般 10Kb。带有遗传筛选标记。有适当的限制酶酶切位点，便于外源 DNA 的插入和筛选。3、请比较 pBR322 载体、pUC 系列载体、 噬菌体载体、M13 噬菌体载体和粘粒载体的结构特征和用途。pBR322 载体和 pUC 系列载体的用途： 用于保存和扩增 2Kb 目的 DNA。 构建 cDNA 文库。 目的 DNA 的测序。 作为核酸杂交时的探针来源。pBR322 载体：由一系列大肠杆菌质粒 DNA 通过 D
39、NA 重组技术构建而成的双链克隆 载体，长为 4.36Kb。含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori ） ，并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。两个抗性基因中分别含有BamH I 和 Pst I 等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源 DNA 片段pUC 系列载体：由 pBR322 质粒和 M13 噬菌体重组构建而成的双链 DNA 质粒载体。多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。含 Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的 lacZ 基因，该基因序列中含有多克隆位点。噬菌体载体： 噬菌体载体：全长约 48.5Kb，其中
40、 60%（约 30Kb）是溶菌生长所必需，中间 40%的区域为非必需，可被外源 DNA 片段代替而不影响 噬菌体的生存。5末端 含 12 核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为 cos 位点， 噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状 DNA 分子用途： 用作一般的克隆载体。 用于构建基因组或 cDNA 文库（22Kb） 。 用于抗体库或随机肽库的构建。 核酸的序列分析。M13 噬菌体：为 6.4Kb 左右的闭环正链 DNA 分子。克隆的外源基因片段1kb。M13 中引入的多克隆位点，正好插入 LacZ 基因内，可利用蓝白色噬菌斑筛选重组体。粘粒克隆载体：由质粒和 噬菌体的
41、 cos 位点构建而成。组成： 质粒复制的起始位点(Ori)。携带抗药基因。 用于插入目的基因的单一酶切位点。噬菌体的 cos 位点。特点：粘粒载体大小为 46Kb ，而插入外源基因长达 4050kb。加入 噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于 噬菌体的具感染能力的颗粒，容易进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。用途： 克隆大片段 DNA。 构建基因组文库。4、简述大肠杆菌表达载体的结构。在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子核糖体结合位点转录终止信号。5、简述基因工程的基本步骤。目的基因的获取载体的选择目的基因和载体的连接重组 DNA 导入受体细
42、胞重组体的筛选和鉴定6、目的基因的获取有哪些途径？1）从基因文库中获取2）逆转录合成 cDNA3）人工合成 DNA 片段4）直接从染色体 DNA 中分离目的基因7、有哪些目的基因和载体连接的方法？1)粘性末端连接：本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点。2) 平末端连接：质粒和目的基因上没有相同的酶切位点3）人工接头：本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点4）通过同聚尾连接：本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点8、有哪些制备感受态细胞的方法？CaCl2 处理，增加大肠杆菌细胞膜通透性。电击法，高压脉冲使细胞膜形成暂时性微孔。9、简述双抗生素筛选法和蓝白斑筛选法的原理
43、。双抗生素筛选法：某些质粒载体如 pBR322 质粒中有 Ampr 和 Tetr 抗性基因，在这两 个基因中装有几个常用的 MCS，如将外源 DNA 片段插入 BamH识别序列时，则此质粒由 Tetr 变为对四环素敏感（Tets ） 。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体，此筛选方法称为双抗生素筛选法蓝白斑筛选法：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的 lacZ 基因，该基因含一段编 码 -半乳糖苷酶氨基末端 145 个氨基酸 -肽的 DNA 片段， IPTG 可诱导此片段合成,此
44、片段能与宿主细胞所编码的缺陷型 -半乳糖苷酶实现基因内 -互补，形成完整的 -半乳糖苷酶，催化指示剂底物 X-gal 形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入lacZ 基因中 MCS，lac-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无 -半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法。10、重组体的筛选和鉴定分别有哪些方法？重组体的筛选1、根据载体的抗药性标志筛选 2、根据载体抗药性标志插入失活选择3、-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法）4、根据插入的外源性基因的性状进行筛选5、核酸杂交技术筛选重组体的鉴定1、根据重组子大小鉴定 2、酶切鉴定 3,PCR 鉴定 4.DNA
45、 序列分析鉴定第七章1 基因表达（gene expression）：DNA 分子将其所承载的遗传信息，通过密码子 -反密码子系统，指导合成功能 RNA 分子和蛋白质分子的过程。2.基因表达调控（gene regulation or gene control）：对基因表达过程的调节。基因表达调控的生物学意义，适应环境、维持生长和增殖；维持个体发育与分化。3.正转录调控(positive)：调节基因的产物是激活蛋白（activator） 。也可根据激活蛋白的作用性质分为：正控诱导系统：效应物使激活蛋白处于活性状态。正控阻遏系统：效应物使活性蛋白处于非活性状态4.负转录调控（negative ）:调
46、节基因的产物是阻遏蛋白（ repressor） 。根据其作用特征又可分为：负控诱导：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因转录；负控阻遏：阻遏蛋白与效应物结合，结构基因不转录5.可诱导调节：编码糖和氨基酸分解代谢蛋白的基因6.弱化子：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列，位于 trpE 基因的起始密码前 162bp 的前导区中的 123-150 位碱基序列。该区的 mRNA 可形成茎- 环结构，有终止的作用。称为弱化子。7.细菌的应急反应：细菌碰到紧急状况(如氨基酸的全面匮乏) ，会产生一个应急反应，包括生产各种 RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止，而打
47、开一些合成氨基酸的基因。应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp ）和鸟苷五磷酸（pppGpp ）,诱导物是空载 tRNA。8. 前导肽：在色氨酸操纵子的前导序列中可能存在前导肽，14 个氨基酸。在第 10 和 11位上有相邻的两个色氨酸密码子。前导区的序列分析：具有 4 个分别以 1、2、3、4 表示的片段，能以两种不同的方式进行碱基配对：1-2、3-4，或 2-3 配对。9. 转录弱化作用： mRNA 转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，这个前导肽的翻译必定对 tRNATrp 的浓度敏感。 10. 信号传导（signal transduction）
48、：细胞通过传感器（sensor）接收外界信号，然后传到调节部位。11.二组分调控系统（two-component systems）：由位于细胞质膜上的传感蛋白（sensor protein）和位于细胞质内的应答调节蛋白（response regulator protein）组成。12. 魔斑（magic spot）：鸟苷四磷酸（ppGpp ）和鸟苷五磷酸 (pppGpp)，可在层析谱上检出。细菌缺乏氨基酸时，会大量合成这两种化合物。影响 RNA 聚合酶与启动子结合。作为警报素，产生应急反应。抑制核糖体和其他大分子的合成，抑制与氨基酸转运无关的系统。活化某些氨基酸操纵子的转录和表达，活化蛋白水解
49、酶等。空载 tRNA 激活焦磷酸转移酶 GTP+ATP pppGpp+AMPppGpp 13.可阻遏调节：合成代谢过程中所必需的小分子物质（氨基酸、嘌呤、嘧啶等）的基因。14 操纵子(operon): 是基因表达的协调单位，由启动子、操纵序列及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵子是原核基因表达调控的一种重要形式。15 断裂基因：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）16 顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列、和可诱导元件等，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用
