1、金汉斯餐饮机构管理公司-研发部第二章化验室检验第二章 理化鉴定2-1 总灰分的测定通常所说灰分就是指总灰分，在总灰分中有包括：水溶性灰分；水不溶性灰分；酸溶性灰分；酸不溶性灰分。一. 准备坩埚（灰化容器）目前常有的坩埚：石英坩埚；素瓷坩埚；白金坩埚；不锈钢坩埚素瓷坩埚在实验室常用，它的物理性质和化学性质和石英相同，耐高温，内壁光滑可以用热酸洗涤，价格低，对碱性敏感。下面坩埚 （1：4）盐酸煮沸洗净降至 200放入干燥室内冷却到室温称重（空坩埚）二样品的处理对于各种样品应取多少克应根据样品种类而定，另外对于一些样品不能直接烘干的首先进行预处理才能烘干。1）湿的液体样品（牛奶，果汁）先在水浴上蒸干
2、湿样。主要是先去水，不能用马福炉直接烘，否则样品沸腾会飞溅，使样品损失，影响结果。2）含水分多的样品（果蔬）应在烘箱内干燥。3）富含脂肪的样品（先提取脂肪，即放到小火上烧直到烧完为止，然后再炭化。）4）富含糖，蛋白质，淀粉的样品在灰化前加几滴纯植物油（防止发泡）取样量的多少应根据样品的种类和性质来决定，食品的灰分与其他成分相比含量较少。三.选择灰化的温度，灰化的温度因样品不同而有差异，大体是果蔬制品、肉制品、糖制品类不大于 525；谷物、乳制品（除奶油外）、鱼、海产品、酒类不大于 525根据上面这些我们可选择测灰分的温度，灰化温度选择过高，造成无机物的损失（NaCL、KCL）也就是说增加灰化温
3、度，就增加了 KCL 的挥发损失，CaCO 3则变成 CaO，磷酸盐熔融，然后包住碳粒，使碳粒无法氧化，所以我们选择温度不能过高。根据所测的样品来选择灰化温度。四.灰化时间对于灰化时间一般无规定，针对试样和灰化的颜色，一般灰化到无色（灰白色），灰化的时间过长，损失大，一般灰化需要 2-5 小时，有些样品即使灰化完全，颜色也达不到灰白色，如 Fe 含量高的样品，残灰蓝褐色，Mn、Cu 含量高的食品残灰蓝绿色，所以根据样品不同来看颜色。五.加速灰化的方法对于一些难灰化的样品（如动物性食品，蛋白质较高的）为了缩短灰化周期，采用加速灰化过程，一般可采用三种方法来加速灰化。1 改变操作方法 样品初步灼烧
4、后取出坩埚冷却 在灰中加少量热水搅拌使水溶性盐溶解，使包住的碳粒游离出来蒸去水分干燥灼烧金汉斯餐饮机构管理公司-研发部2 加 HNO3(1：1)或 30%H2O2 使未氧化的碳粒充分氧化并且使它们生成 NO2和水，这类物质灼烧时完全消失，又不至于增加残留物灰分重量。3 加惰性物质 如 Mg ,CaCO3等，这些都不溶解，使碳粒不被覆盖，此法同时作空白实验。六.测定步骤在坩埚中称取定量样品在电炉中炭化至无烟 在 500马福炉中灼烧到灰白色 冷却到 200 入干燥皿冷却到室温称重灼烧 1 小时 冷却到恒重七计算灰分%=灰分重量/样品重量 *1002-2 水分测定方法 -常压干燥法1、特点与原理 特
5、点：此法应用最广泛，操作以及设备都简单，而且有相当高的精确度。 原理：食品中水分一般指在大气压下，100左右加热所失去的物质。但实际上在此温度下所失去的是挥发性物质的总量，而不完全是水。2、干燥法必须符合下列条件（对食品而言）： 水分是唯一挥发成分这就是说在加热时只有水分挥发。 例如，样品中含酒精、香精油、芳香脂都不能用干燥法，这些都有挥发成分。 水分挥发要完全对于一些糖和果胶、明胶所形成冻胶中的结合水。它们结合的很牢固，不宜排除，有时样品被烘焦以后，样品中结合水都不能除掉。因此，采用常压干燥的水分，并不是食品中总的水分含量。 食品中其它成分由于受热而引起的化学变化可以忽略不计。只看符合上面三
6、点就可采用烘箱干燥法。烘箱干燥法一般是在 100105下进行干燥。 3、烘箱干燥法的测定要点 取样（称样）在采样时要特别注意防止水分的变化，对有些食品例如奶粉、咖啡等很容易吸水，在称量时要迅速，否则越称越重。 干燥条件的选择三个因素：温度；压力（常压、真空）干燥；时间。一般是温度对热不稳定的食品可采用 70105；温度对热稳定的食品采用120135。4、操作方法清洗称量皿烘至恒重称取样品放入调好温度的烘箱（100105）烘 1.5 小时于干燥器冷却称重再烘 0.5 小时称至恒重（两次重量差不超过 0.002g 即为恒重） 油脂或高脂肪样品，由于脂肪氧化，而后面一次重量反而增加，应以前一次重量计
7、算。 对于易焦化和容易分解的食品，可以选用比较低的温度或缩短干燥时间。金汉斯餐饮机构管理公司-研发部 对于液体与半固体样品，要在称量皿中加入海砂，使样品疏松，扩大蒸发的接触面，并且用一个玻璃棒作为容器。先放到沸水浴中烘，烘的差不多，再放到烘箱烘，否则不加海砂样品容易使表面形成一层膜，造成水分不易出来，另外易沸腾的液体飞沫使重量损失。计算：水分= G 2 G 1 / W 固形物（%）=100 水分%G1 恒重后称量皿重量（g）G2 恒重后称量皿和样品重量（g）W 样品重量（g）固形物 指食品内将水分排除以后的全部残留物。其组分有蛋白质、脂肪、粗纤维、无氮抽出物和灰分等。5、烘箱干燥法产生误差的原
8、因 样品中含有非水分易挥发性物质（酒精、醋酸、香精油、磷脂等）； 样品中的某些成分和水分的结合，使测的结果偏低（如蔗糖水解为二分子单糖），主要是限制水分挥发； 食品中的脂肪与空气中的氧发生氧化，使样品重量增重； 在高温条件下物质的分解（果糖对热敏感）；果糖 C 6H12O6 大于 70 C 6H6O3 + 3H2O 被测样品表面产生硬壳，妨碍水分的扩散；尤其是对于富含糖分和淀粉的样品； 烘干到结束样品重新吸水。2-3 总酸度的测定（滴定法）一、原理 食品中的有机酸（弱酸）用标准碱液滴定时，被中和生成盐类。用酚酞作指示剂，当滴定到终点（pH=8.2,指示剂显红色）时，根据消耗的标准碱液体积，计算
9、出样品总酸的含量。其反应式如下：RCOOH + NaOH RCOONa +H 2O二、样品的处理与制备1.固体样品将样品适度粉碎过筛，混合均匀，取适量的样品 ，加入少量无二氧化碳的蒸馏水，将样品溶解到 250ml 容量瓶中，在 75-80水浴上加热 0.5 小时（若是 果脯类，则在沸水中加热 1 小时），冷却、定容 ，用干燥滤纸过滤，弃去初液，收集滤液备用。2.含二氧化碳的饮料、酒类将样品于 45水浴上加热 30min， 除去二氧化碳，冷却后备用。3.调味品及不含二氧化碳饮料、酒类将样品混合均匀后直接取样 ，必要时也可加适量水稀释，若混浊则需过滤。4.咖啡样品将样品粉碎经 40 目筛 ，取 1
10、0g 样于三角瓶，加 75ml 80乙醇，加塞放置 16 小时，并不时的摇动，过滤。5.固体饮料称取 5g 样品于研钵中，加入少量无 CO2蒸馏水，研磨成糊状，用无 CO2蒸馏金汉斯餐饮机构管理公司-研发部水移入 250ml 容量瓶中定容，摇匀后过滤。三.样品滴定准确吸取制备的滤液 50ml，加入酚酞指示剂 2-3 滴，用 0.1mol/L 标准碱液滴定至微红色 30 秒不褪色，记录用量，同时做空白实验。以下式计算样品含酸量。总酸度（%） =C（V 1V 2）K V3100m V4式中：C-标准氢氧化钠溶液的浓度 mol/LV1-滴定所消耗标准碱液的体积 mlV2 -空白所消耗标准碱液的体积
11、mlV3 -样品稀释液总体积 mlV4-滴定时吸取的样液的体积 mlM-样品质量或体积（g 或 ml）K-换算为适当酸的系数，即 1mol 氢氧化钠相当于主要酸的克数因为食品中含有多种有机酸，总酸度测定结果通常以样品含量最多的那种酸表示。例如一般分析葡萄及其制品时，用酒石酸表示，其 K=0.075；测柑橘类果实及其制品时，用柠檬酸表示，其 K=0.064；分析苹果及其制品时，用苹果酸表示，其 K =0.067；分析乳品、肉类、水产品及其制品时，用乳酸表示，其 K=0.090；分析酒类、调味品，用乙酸表示，K=0.060。四、注意事项：1.样品浸泡，稀释用的蒸馏水中不含 CO2，因为它溶于水生成
12、酸性的 H2CO3,影响滴定终点时酚酞的颜色变化，一般的做法是分析前将蒸馏水煮沸并迅速冷却，以除去水中的 CO2 。样品中若含有 CO2 也有影响，所以对含有 CO2的饮料样品，在测定前须除掉 CO2。2.样品在稀释用水时应根据样品中酸的含量来定，为了使误差在允许的范围内，一般要求滴定时消耗 0.1mol/LNaOH 不小于 5ml，最好应在 1015ml左右。3.由于食品中含有的酸为弱酸，在用强碱滴定时，其滴定终点偏碱性，一般pH 在 8.2 左右，所以用酚酞做终点指示剂。4.若样品有色（如果汁类）可脱色或用电位滴定法也可加大稀释比，按 100ml样液加 0.3ml 酚酞测定。5.各类食品的
13、酸度以主要酸表示，但有些食品（如牛奶、面包等）也可用中和100g（ml）样品所需 0.1mol/L（乳品）或 1mol/L（面包）NaOH 溶液的 ml 数表示，符号 0T。新鲜牛奶的酸度为 16-180T， 面包酸度为 3-9 0T2-4 食品中有效酸度的测定（PH）一 测定 PH 的方法有 PH 试纸法，标准色管比色法，PH 计测定法二 试剂 1.PH=4.01 标准缓冲溶液（20）2.PH=6.88 标准缓冲溶液（20）3.PH=9.22 标准缓冲溶液（20）4.直接按市售的 PH 标准缓冲溶液的盐类所表明的方法配置金汉斯餐饮机构管理公司-研发部三 仪器酸度计附 231 型玻璃电极和 2
14、32 型甘汞电极四 操作方法1PH 计校正：先将 PH 计的电极接好，开动电源，调节补偿温度按钮后，将电机浸入缓冲溶液中，然后按下读数开关，调节电位调节器，使指针调在缓冲溶液的 PH 值上。放开读数开关，指针应只在 7，重复上述操作两次以上。2.样品测定:鱼类，肉类样品一般在 1：10 的中型水溶液中浸泡，过滤，取滤液进行测定。测定时先用标准 PH 也进行校正，但电极需先用水冲洗，用滤纸轻轻吸干，然后再进行测定。PH 直接从表头上读出。样品测定完毕后，将甘汞电极取下来放好，玻璃电极浸在下端有棉花的玻璃瓶的水中。五 说明1.玻璃电极使用后要浸入在水中2.PH 计经标准 PH 缓冲夜校正后，不能在
15、移动校正旋钮.第三章 微生物检测3-1 细菌总数一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养 48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因
16、此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的 10 倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出 1mL 置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为 48 小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每 ml）原始样品中所含细菌菌落总数。金汉斯餐饮机
17、构管理公司-研发部基本操作一般包括：样品的稀释倾注平皿培养 48 小时计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。检验方法参见：GB4789.2-94 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定SN0168-92 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数三、说明（一）样品的处理和稀释：1操作方法：以无菌操作取检样 25g（或 25ml)，放于 225mL 灭菌生理盐水或
18、其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成 1：10 的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以 800010000r/min 的速度处理 1min，制成 1：10 的均匀稀释液。用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成 1：100 的稀释液。另取 1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。2无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有
19、细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用 75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露 15 分钟，每个平板不得超过 15 个菌落。3采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。4样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。为减少稀释误差，SN 标
20、准采用取 10mL 稀释液，注入 90mL 缓冲液中。金汉斯餐饮机构管理公司-研发部5稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。（二）倾注培养1操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择 23 个适宜稀释度，分别在制 10 倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取 1ml 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至 46营养琼脂培养基注入平皿约 15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有 1ml 稀释液（不含样品）的灭菌平
21、皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置 361温箱内培养 482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2倾注用培养基应在 46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从 1220ml 不等，一般以 15ml 较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间
22、不宜超过 20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。4培养温度一般为 37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用 30）。培养时间一般为 48h，有些方法只要求 24h 的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养 48h 后，培养基失重不应超过 15。5为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于 4环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。（三）计数和报告1操作方法：培养到时间后，计数每个平
23、板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每 ml）中的菌落数，进行报告。金汉斯餐饮机构管理公司-研发部2到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过 24h。3计数时应选取菌落数在 30300 之间的平板（SN 标准要求为 25250 个菌落），若有二个稀释度均在 30300 之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于 2 取平均数，比值大于 2 则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。4若所有稀释度均不在计数区间。如均大于 3
24、00，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于 30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于 300，有的又小于 30，但均不在 30300 之间，则应以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于 1 乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。5不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告
25、的依据。6当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘 2 代表全平板的菌落数。7当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于 300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或 1/4 计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。8菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在 1100 时，按实有数字报告，如大于 100 时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计
26、算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm 2）报告。稀释液及菌落数例次 lO-1 10-2 lO-3 两稀释液之比菌落总数(个g或m1)报告方式(个g或m1)金汉斯餐饮机构管理公司-研发部l2345678多不可计多不可计多不可计150多不可计27O多不可计16429527130多不可计1l030520466083135O12一1.62.22一一 一一1640037750271001 5003l 3000270 l10305001,6000或1.610 438000或3.8lO 427000或2.710 41500或1.510 3310000
27、或3.110 5270或2.7lO。lO31000或3I103-2 大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在 37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在
28、自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用
29、于食品卫生工作中。二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在 37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养 482h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养18-24h，观察菌
30、落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管 361培养 242h，观察产气情况。金汉斯餐饮机构管理公司-研发部报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查 MPN 表，报告每 100ml（g）大肠菌群的 MPN 值。具体操作参见 GB4789.3-94 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国 FDA 的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管 LST 肉汤。361培养 482h，观察是否产气。证实试验：将产气管培养物接种
31、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，361培养 482h，观察是否产气。以 BGLB 产气为阳性。查 MPN 表，报告每 ml(g)样品中大肠菌群的 MPN 值。具体操作参见 SN0169-92 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法三、说明1MPN 检索表：MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN 检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加 10 倍。注意
32、国家标准和行业标准中所附 MPN 表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。金汉斯餐饮机构管理公司-研发部大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳 性 管 数 95%可信度1ml(g)*3 0.1ml(g)*3 0.01ml(g)*3MPN100ml(g) 下限 上限000000000123303060905 900000111101233060901205 13000002222012360901201600000333301239013016019011110000012340701101505102002101111111101237011015019010302303601111222
33、2012311015020024030 360111133330123160200240290金汉斯餐饮机构管理公司-研发部2222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890接上表大肠菌群最可能数(MPN) 检索表阳 性 管 数 95%可信度1ml(g)*3 0.1ml(g)*3 0.01ml(g)*3MPN100ml(g) 下 限 上 限222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407
34、015012001300380033331111012343075012001600071403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000金汉斯餐饮机构管理公司-研发部2初发酵和证实试验：无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在 37分解乳糖产酸产气”。初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，
35、经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。3产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。4挑选菌落：国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行
36、观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。5抑菌剂：大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性
37、菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中 LST 肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB 肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。金汉斯餐饮机构管理公司-研发部抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。3-3 沙门氏菌及检验 人沙门氏菌病有四类综合症：沙门氏菌病；伤寒；非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，通常表现为轻度，持久性腹泻。伤寒实际上是由伤
38、寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过 10%，而对经过适当医疗的病人其致死率低于 1%，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致，能影响所有器官，有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。一、致病性沙门氏菌胃肠炎，潜伏期一般 6-72 小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般 1-2 天或更长。感染剂量为 15-20 个菌，死亡率达 1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便，
39、沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。沙门氏菌属也是嗜温性细菌，在中等温度，中性 pH，低盐和高水活度条件下生长最佳。生长最低水活度为 0.94。兼性厌氧，对中等加热敏感。同样，该菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染；蒸煮；巴氏消毒等控制。正常家庭烹调，个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染，以及控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的
40、发生。二、检验因沙门氏菌是最常见的食源性细菌病原体，因此在本节中重点介绍沙门氏菌的检验。沙门氏菌是食物传播病原菌中研究最活跃的细菌。从食品中分离和鉴定沙门氏菌，当前通用的方法学分 5 个步骤：金汉斯餐饮机构管理公司-研发部1.前增菌-第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2.选择性增菌-在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。3.选择性平板分离-这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。4.生物化学筛选-排除大
41、多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。这五个步骤代表理想状况。不过一个有经验的检验员，可能在一个或几个步骤中看出特性和差别。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g 食品为标准分析单位。三、从食品中分离沙门氏菌样品的制备下面的方法是以 25g 样品为检测单位，样品：肉汤为 19 的比例。除非另有说明，根据混合程度，加足够的肉汤保持 19 的比例。对不需准确称量检测的样品，例如：田鸡腿，可参看特定方法说明。1、干蛋黄、干蛋白、干全蛋、液奶（去脂牛奶，含 2%脂肪牛奶，全脂奶，和脱脂奶）、粉状调制食品（蛋糕，甜饼，炸面圈，饼干和
42、面包）、婴儿食品、口食或软管进食含蛋的食品：检验前的冷冻样品最好不要解冻。如果冷冻样品必须软化以获取待检测部分，则尽可能迅速的解冻所需部分，使竞争菌数少增加或降低沙门氏菌的可能损伤。解冻需在 45以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行 15min或在 25，18 小时内解冻。无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。非粉状的样品，加入 225mL 灭菌乳糖肉汤。如果制品是粉状，加入约 15mL 灭菌乳糖肉汤，用灭菌玻璃棒，匙或灭菌压舌器搅拌，使成均匀悬液。再加 3 份乳糖肉汤 10mL，10mL，190mL，使总量为 225mL。充分搅拌，直
43、到样品完全悬浮没有团块为止。盖紧瓶盖在室温静置60min。振摇使充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时用灭菌的 1NNaOH 或 1NHcl调节 pH 至 6.80.2。在测定最终 pH 前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后将瓶盖旋松约 1/4 圈，置 35培养 242 小时。以下步骤按四，1-10 进行。2、蛋类：金汉斯餐饮机构管理公司-研发部A、含壳蛋：用硬刷子在水流下刷洗蛋。把蛋在含 0.1%十二烷酸磺酸钠（SDS）的 200ppm 氯离子溶液中浸泡 30min。加 8mL 5.25%次氯酸钠到含 1g SDS 的 992mL 蒸馏水中，制备 200ppm cl-/0.1%SDS 溶液。这种消毒
44、剂需在使用前临时制备。无菌操作打开蛋，使用灭菌的蛋分离器，弃去蛋白。无菌操作称取 25g 蛋黄到灭菌的 500mL 锥型瓶或其他合适容器内。加 225mL 胰胳胨（胰化物）大豆肉汤（TSB），并振荡充分混匀。在室温下静置 60 分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2，置 35培养 242小时，以下步骤按四，1-10 继续。B、液全蛋（均状）：无菌操作称 25g 置于无菌的 500mL 锥形烧瓶或其它合适容器中。加 225mLTSB 并振荡充分混匀。按上面所述继续。C、煮硬的蛋（鸡蛋，鸭蛋或其他蛋类）：目前，不知道蛋白中的沙门氏菌抑制因子是否具有热稳定
45、性。因此，无菌操作分离蛋白和蛋黄。称取 25g 粉状蛋黄固体到无菌 500mL 锥型瓶或其他合适容器中。加 225mLTSB 并旋转充分混匀。按上面所述继续。3、脱脂乳粉A、速溶：无菌操作称取 25g 样品，加入灭菌烧杯（250mL）或其它合适容器内。经灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压灭菌）漏斗，往灭菌的 500mL 锥形烧瓶或其它合适容器中（装有 225mL 煌绿水），缓缓倾注 25g 检测单位，使其覆盖在煌绿水表面。也可将多份 25g 检验单位按比例 倒入相应份数的煌绿水表面。按每 1000mL 灭菌蒸馏水中加 1%煌绿溶液 2mL 配置煌绿水。将盛有样品前增菌培养基的容器静置 605 分
46、钟。松松地盖上容器盖，不需要混合或调节 pH 值，于 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。B、非速溶：按上述 A 脱脂乳粉的方法进行，只不过不允许将多份检验单位按比例合并检验。4、全脂奶粉：无菌操作称取 25g 样品，加入无菌的，带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。加入 225mL 灭菌蒸馏水并振荡充分混匀。盖紧在室温下静置60 分钟。使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。在测定最终 pH 前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后加 0.45mL1%的煌绿染液并充分混匀。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时，以下步骤按四
47、，1-10 继续。5、酪蛋白：无菌操作称取 25g 样品，加入无菌均质杯中，加 225mL 灭菌乳糖肉汤到样品中并匀质 2 分钟。无菌操作，把已匀质的混合物转移到灭菌，带螺旋帽的500mL 广口瓶或其他合适的容器内。盖紧盖子在室温下静置 60 分钟。振摇使充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。在测定最终 pH 前金汉斯餐饮机构管理公司-研发部要盖紧瓶盖并充分混匀。旋松瓶盖约 1/4 圈后，置 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。6、大豆粉：无菌操作称取 25g 样品，加入灭菌烧杯（250mL）或其它合适容器内。用灭菌玻璃或纸质（用带卷好以备高压
48、灭菌）漏斗，往装有 225mL 乳糖肉汤的灭菌的 500mL 锥形烧瓶或其它合适容器中，缓缓倾注 25g 检测单位，使其覆盖在乳糖肉汤表面。检测单位（25g）不可多份按比例混合检测。容器静置 605 分钟。松松地盖上容器盖，不需要混合或调节 pH 值，于 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。7、含蛋制品（面条，蛋卷，通心粉，意大利面条）、干酪、生面团、调制色拉（火腿，蛋，鸡肉，金枪鱼，火鸡）、新鲜的、冷冻的、或干的水果和蔬菜、果仁、甲壳类动物（小虾，蟹，小龙虾，LANGOSTINOS，龙虾）和鱼：检测前冷冻样品最好不要解冻，如果冷冻样品必须软化以取其检测部分，则要在持续搅拌并
49、带有自动调温器控制的 45水浴内 15 分钟内解冻。或者在2518 小时内进行。无菌操作称取 25g 样品，加入灭菌的均质器中。加入 225mL 灭菌的乳糖肉汤并均质 2 分钟。再无菌操作转移已均质的混合物到无菌的带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。盖紧瓶盖，于在室温下静置 60 分钟。振摇使其充分混匀，用试纸测定 pH 值。必要时调节 pH 值至 6.80.2。充分混匀。旋松瓶盖约 1/4 转后，置 35培养 242 小时，以下步骤按四，1-10 继续。8、干酵母：无菌操作称取 25g 样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL），或其他合适的容器内。加入 225mL 灭菌胰酪胨（胰化）大豆肉汤，充分混匀使酵母形成均匀悬液。盖紧瓶盖
