1、实验 十 一 T淋巴细胞玫瑰花结实验,College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity,一、实验目的,1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵羊红细胞悬液的制备。 2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解该技术在实际工作中的用途。,人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以形成以T细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环,为E花环试验(erythrocyte rosette test)。应用最广的有总E花环试验(Et,t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea,a为act
2、ive 的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。,二、实验原理,E玫瑰花环实验判断细胞免疫功能,T淋巴细胞玫瑰花结电镜照片,T淋巴细胞玫瑰 花结示意图,三、实验仪器、材料和试剂,1、材料 无菌抽取的人静脉血,加入事先有适量肝素液的试管内,混匀抗凝。 健康绵羊红细胞 小牛血清（经5630min灭活）。按10：1加入洗过的压积兔红细胞，混匀。于37吸收3
3、0min，4冰箱过夜。然后以2000r/ min离心10min。取上清液经蔡氏滤器过滤后，无菌条件下分装于小瓶。低温保存。,三、实验仪器、材料和试剂,2、试剂 抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液。 0.90%的生理盐水。 Alsvers溶液。 Hank溶液。 细胞分层液：上海试剂二厂产品。 0.8%戊二醛溶液：使用前15min用生理盐水或Hank液配制。 染色液：瑞氏或Giemsa染液。 1%醋酸溶液 。,三、实验仪器、材料和试剂,3、仪器 光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊子、蔡氏滤器、刻度离心管（10ml）、滴管及吸管、载玻片和盖玻片。,四、方法与
4、步骤,1.绵羊红细胞悬液的制备 依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置4倍体积的Alsvers 液中，摇匀（放置4冰箱保存，限710天内用）。 临用前用Hank液洗涤3次，每次1000r，离心5min。取压积的绵羊红细胞用Hank液配成1% 的细胞悬液（ 约2107 个/ml）,四、方法与步骤,洗涤后悬浮的红血球,红血球在血球计数板上的密度,密度梯度离心分离纯化淋巴细胞示意图,四、方法与步骤,2.淋巴细胞的分离和制备取1支洁净、干燥的离心管加入人抗凝血1ml，再加入1mlHanks液稀释血液； 取1支洁净、干燥的离心管，加入1ml细胞分层液； 用吸管吸取上述稀释血液，沿离心管管壁加于细胞分层液的表
5、面（不能冲乱液面）。以3000r/min离心20min，可出现分层，详见图。,经离心分离纯化后的血浆和分层液之间的灰白色淋巴细胞照片,四、方法与步骤,用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层吸至含1.5mlHank液的离心管中，混合后后2000r/min离心5min。弃上清，沉淀用Hank液重复洗一次，于沉积细胞中加0.5mlHank液混匀, 取20ul淋巴细胞悬液，加0.78ml1%的醋酸混匀，将淋巴细胞配成5x106个/ml。,3.反应：取淋巴细胞悬液（5106个/ml）0.1ml；加入灭活吸收的小牛血清0.1ml，再加入2107 个/ ml绵羊红细胞悬液0.2ml混匀；使淋巴细胞与绵羊
6、红细胞的比例分别为1：8（活性玫瑰花结）。置37孵育5min，其间轻轻摇动23次。取出离心管，以500 r / min离心5min，将离心管置40冰箱放置5min。取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花 环脱落）。沿管壁加入0.8%戊二醛溶液3滴，再轻 旋转混匀。置4，5min。自冰箱取出后，以500 r / min离心5min，弃 上清，沉淀混匀制片。,四、方法与步骤,4、制片取1滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在蒸馏水中置4冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自然干燥或微风吹干后，用瑞氏染液染色510min。用自来水冲去染液，待干燥后镜检计数。 5、计数方法在高倍镜或油镜下数200个淋巴细胞，每个淋巴细胞结合3个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞。形成玫瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示。,四、方法与步骤,五、实验结果,T淋巴细胞玫瑰花结光镜照片,1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细胞受体会从T细胞表面脱落。 2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散开消失。,六.注意事项,七.思考题,试述E玫瑰花结实验的目的及其意义。 简述活性E玫瑰花结实验条件。 计算实验中形成活性玫瑰花结的百分率 注：E花结形成百分率 = 形成花结细胞数/（花结细胞数+未形成花结细胞数）X100%,
