1、湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用1前 言胚胎干细胞(Embryonic stem cells ，ESCs ) 是胚胎源性多能干细胞是从早期胚胎内细胞团（inner cell mass，ICM)或着床后胚原始生殖细胞(Primor- dial germ ceils，PGCs )分离和克隆出来的一种具有无限增殖能力和全向分化能力的干细胞 1。这两类细胞均可分化为包括神经细胞、造血干细胞、心肌细胞等在内的各种细胞 2。ESCs 的发育全能性备受科学界的关注，而它所具有的广泛应用价值，已经成为当今国内外生命科学研究的热点。 湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用2第一章
2、ESCs 研究中的相关知识11 胚胎干细胞 1981年英国剑桥大学 Evans和 Kaufman首次对延迟着床的小鼠囊胚进行体外培养,首次分离得到小鼠 ESCs。此后，人们又相继用不同的方法从猪、牛、兔、羊、猴等哺乳动物分离得到 ESCs。迟至 1998年，美国威斯康辛大学的生物学家 James Thomson 及其同事才首次分离、建成了第一个人的胚胎干细胞系 3。这一成果给移植治疗、药物发现及筛选等等带来深远的影响，打开了在体外培养更多类型的可供移植治疗的人体细胞、组织和器官的大门。 12 胚胎生殖细胞 (Embryonic germ cells，EGCs) EGCs是来自于早期胎儿生殖嵴的
3、 PGCs，是早期胚胎多能干细胞中的一种，具有自我更新和无限增殖的能力，能分化成代表三个胚层组织细胞能力的干细胞。Matsui 等(1992 )和Res- nick等(1992)体外长期培养小鼠 PGCs，建立了小鼠 PGCs系,发现在适宜条件下,其在形态上和发育上类似于 ESCs，称为 EGCst4。1998 年，美国学者 Shamb- lott等首先从受精后59周的人胚胎生殖嵴分离，培养并建立了 EGCs系。 13 原始生殖细胞 PGCs是生殖谱系区别于体细胞的最初形式，是哺乳动物生殖细胞的祖细胞，早在 1980年以前，Jeon 和 Brinster就分别对小鼠的 PGCs的形态结构和能量
4、代谢进行了研究；1992 年，Matsui等和 Resniek等以分离小 鼠胎儿的 PGCs为材料,培养传代获得 ESCs.从而首次较为全面地证实 PGCs同样可以作为 ESCs分离克隆的原材料 5。 湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用3第二章 ESCs 的来源2.1 传统方法从发育良好的囊胚中分离内细胞群细胞或从 5-9周的胚胎生殖腺中分离胚胎干细胞。培养条件：需要特殊的培养液、饲养细胞（人或胚鼠的成纤维细胞） 、需要加入白雪病抑制因子抑制分化。1981 年美国科学家 Evans和 Kaufman从小鼠胚胎分离出胚胎干细胞病成功建立，从此开辟了哺乳动物胚胎干细胞研究的新纪元。
5、1990 年 Thomsn和 Gearhrt利用内细胞团和原始生殖细胞分别建立了人的胚胎干细胞系，这一结果的宣布将胚胎干细胞的研究又解开了新的一页！国内在胚胎干细胞方面的综合性研究起步晚（1989 年） ，但发展迅速。在基础研究方面，尚克刚、赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系，盛慧珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。在研究方面，著名胚胎工程专家窦忠英的科研小组已第 6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动样细胞团。中国军事医学科学院发现了“人胚胎干细胞素” ，用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果！2.2 体细胞核移植通过显微操作和细胞融合技术，见单细胞核体（卵裂球或体细胞的核）一
6、如去核的受体（卵母细胞或受精卵）胞质构成重组胚，通过对重组胚的激活、培养得到动物胚胎干细胞。Willmut等从一只六岁妊娠母羊乳腺中采取细胞，经培养传代和血清饥饿法处理后，通过核移植得到 277枚融合胚，再经体内培养后有 29枚发育到囊胚，移植给 13只受体母羊，其中有一只妊娠并最终产下了一只活羔，从而诞生了世界首例成年体细胞核移植后代。自从利用分化的成年乳腺细胞的大第一只体细胞克隆绵羊多利，其它物种的克隆也取得了很大的进展。体细胞克隆牛、山羊、鼠、猪和兔相继获得成功。在目前的克隆实验中，不同物种间克隆的效率略有区别，但总效率不高！2.3 iPS细胞iPS细胞首先是由 Takahashi和 Y
7、amanaka在 2006年建立的。他们利用叛转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了 4个与多能型有关的基因Oct4、Sox2、c-myc、Kif4。接着，利用里一个多能性标志分子 Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选，最终得到了具有胚胎干细胞某些特征的多能性干细胞，并命名“诱导产生的多能性干细胞” 。一年后，3 家实验室各自的研究证实了该结果的可靠性，并且提高了生产的 iPS细胞的质量。不久，另外两项研究相继报道了利用形态学作为筛选标准来建立 iPS细胞的方法，这一方法在建立人类 iPSxde 研究中具有潜在的优势。在新近研究中，Yamanaka 等人用他们在小鼠中使用过的 4种银子实湖北
8、大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用4现了人类皮肤成纤维细胞的重编程；而 Thomson实验室选用的是他们自己筛选出的 4种银子Oct4,Sox2,Nanog和 Lin28，其中 Oct4和 Sox2在 Yamanaka的研究中也很关键。紧随其后，Yamanaka小组又在原有工作基础上取得重要突破；从 4个转录因子中去掉了肿瘤相关因子 C-Myc，使 iPS细胞的产生更为安全。目前，已有研究将 iPS细胞用于治疗镰刀型贫血症小鼠。在短短一年多的时间里，iPS 细胞的建立方法有了明显的改善，并且成功的应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的治疗，说明这一方法既有可操作性和稳定性，并且其安全
9、性也在不断提高，因此这种方法对将来的医学研究有着巨大的价值！湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用5第三章 ESCs 的基本特征31 形态学特性 各种动物的 ESCs具有与早期胚胎细胞相似的形态学结构： 细胞体积小，胞质胞浆少，细胞核大，有一个或多个核仁，胞质结构简单，散布着大量的核糖体和线粒体，核形正常，保留了双倍体性质。在体外培养的小鼠 ESCs紧密堆积，呈集落状生长，细胞之间界限不清，集落边缘可见少量已分化的扁平上皮细胞或梭形成纤维细胞。不同动物胚胎干细胞直径有所不同。总的来说，ESCs 具有与胚胎细胞相似的形态特征。 32 基本特征 321 多能性(Pluripotency
10、) ESCs的多能性是指 ESCs具有分化出多种细胞组织的潜能，参与部分组织的形成。表明ESCs发育多能性的检测方法很多，主要有：形成类胚体：体外培养诱导分化实验，将 ESCs在不含分化抑制物的培养基上培养。可形成胚样结构类胚体，类似于正常胚胎的囊胚期，随后可进 行不同程度的分化产生多种分化细胞。特定组织：将 ESCs在含有特定添加物的培养基中培养，可定向分化形成特定组织。嵌合体：通过显微注射或其它方式使 ESCs与受体胚结合，嵌合后，嵌合体就会参与多种组织发育。322 可操作性 ESCs的可操作性，是指 ESCs可进行遗传操作选择(如导入异源基因、基因重组)等生物学特性。在体外抑制分化培养时
11、，ESCs 不但可以增殖，而且可以被用来进行各种操作，而这一点是以 ESCs的以下两方面特性为前提的：在对 ESCs进行各种操作的过程中，其仍能保持其扩增和发育的全能性和多能性。用于移植时，不易产生免疫排斥反应。由于来源于着床前胚胎的 ESCs 的某些细胞表面免疫相关蛋白(如 MHC)还未来得及表达，用于移植时不易产生免疫排斥反应，因此使其成为移植治疗和细胞治疗的潜在资源 6。 湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用6323 全能性(totipotenty) ESCs的全能性是指其在解除分化抑制的条件下，能发育为构成机体不同细胞类型中包括生殖腺在内的任何一种细胞的潜 力。ESCs
12、具有很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身 200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织和器官。细胞全能性的实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。 33 ESCs 建系概况 ESCs建系的原理是将早期胚胎或是用外科手术法得到 的内细胞团或者 PGCs，与分化抑制物共同培养，使之增殖而又保持未分化状态， 这样代代相传，从而使数量有限的胚胎或者 PGCs能够成千上万倍的克隆。湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用7第四章 PGCs 用于胚胎干细胞培养41 意义 ESCs因其发育的全能性和多样性而备受关注。虽然来源于 PGCs的 ESCs与来源于 ICM
13、的细胞同属胚胎干细胞系，但相比之下，前者具有着更加巨大的科学意义和实践价值：由于获得囊胚内细胞团来源的 ESCs需要破坏具 有生命的胚胎，所以这项研究在许多国家是被禁止或严格限制的 7，而 PGC来源于早期流产的胚胎，于是来源于 PGCs的 EGCs系的建立给研究人员带来了新的希望；PGcs 是胚胎形成后机体的干细胞，与胚泡期的内细胞团相比，经历了着床的筛选，而生理状态下有相当量的胚泡因生长发育不良而不能正常着床并自行排出，因此 PGCs的健康程度应远远高于 ICM8；虽然 PGCs用于 ESCs的培养还存在诸多问题，但无论在数量上还是取材方法上，PGCs 的获取均比桑椹胚和囊胚的获取容易,因
14、而更具有实际的应用价值。 4.2 PGCs用于 ESCs培养的影响因素 4.2.1 基础培养基的选择 ESCs的体外培养工作要求在严格的无菌条件下进行。常规使用的培养液有白血病细胞抑制因子(LIF)、胎牛血清、L 一谷氨酸、非必须氨基酸(NEAA)以及高浓度的 DME等。因 DMEM比较适于生长速度快和呈集落状生长的细胞，而 PGCs正符合这一特点。因此采用 DMEM为基础培养液是能够满足胚胎干细胞和饲养层细胞的生长要求的 9。 4.2.2 饲养层对胚胎干细胞的影响 适宜饲养层的使用使得体外培养的 PGCs增殖成为可能。目前广泛应用的饲养层有三种，STO(一种已建系的小鼠胚胎成纤维细胞)、Pm
15、ef(小鼠原代胚胎成纤维细胞)。由于后者所模拟的体外培养条件与 PGCs在体内生长的环境更为接近。故更有利于 ESCs生长 10。近年来，研究人员通过实验发现，以睾丸支持细胞(SCs)作为饲养层与 PGCs共饲养，可明显提高 PGCs的增殖能力 11，SCs 除可以产生大量 CL外， 还可产生层粘连蛋白(LN)(一种黏附蛋白)，另外，SCs 还能分泌多种内源性生长因子和分泌抑制因子，包括 LIF、SCF(干细湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用8胞生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞因子)等。因此，从理论上说，可提取动物睾丸 SCs，然后将 PGCs与 SCs共培养，不仅可促进
16、PGCs贴壁。而且能有效地抑制体外培养中 PGCs的分化，的确是一项值得继续研究与开发的好方法。 湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用9第五章 ESCs 的应用前景ESCs的应用最主要的应用是基础科学研究、医学和农业科学等方面，特别是在发育生物学、克隆动物、药学研究以及组织器官的修复移植等方面有着无比广泛的应用前景 12。51 克隆动物的生产 由于 ESCs具有全能性和多能性，并可以在体外增殖、 分化，因而是克隆动物的理想材料，ESCs 的运用大大加快了家畜育种工作的进程，迅速提高有利于基因及其组合在群体中的比例。52 器官移植 ESCs作为一种“种子细胞”为临床的组织、器官移植
17、提供 了大量的材料，hESC 经过免疫排斥基因剔除后再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥，这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。53 组织和器官的修复 由于 ES细胞具有多能性，可发育分化为三胚层细胞，即发育分化成机体所有类型组织细胞的能力，任何因物理、化学或生物因素等造成的细胞损伤或病变都可以通过移植由 ES细胞定向分化而来的特异组织细胞或器官来治疗。目前，运用药物或细胞因子诱导 ES细胞定向分化为神经细胞 13、心肌细胞、肝细胞 14、软骨细胞等已多有报导。5.4 动物发育生物学研究 近年来细胞分化是发育生物学的核心问题之一，至今有许多问题还不清楚
18、，而体外培养PGCs并建立 ESCs系提供了在细胞和分子水平上研究哺乳动物发育生物学提供了理想的实验体系。5.5 药学研究方面湖北大学自考独立本科段论文 胚胎干细胞的研究与应用10胚胎干细胞系可分化为多种细胞类型，又是能在培养基中不断自我更新的细胞来源。它发展为胚体后的生物系统，可模拟体内细胞与组织间复杂的相互作用，这在药物研究领域具有广泛的用途。胚胎干细胞有望在短期内就能体现的优势在于药物筛选中。目前用于药物筛选的细胞都来源于动物或癌细胞这样非正常的人体细胞，而胚胎干细胞可以经体外定向诱导，为人类提供各种组织类型的人体细胞，这使得更多类型的细胞实验成为可能。虽不会完全取代在整个动物和人体上的
19、实验，但会使药品研制的过程更为有效。当细胞系实验表明药品是安全的且效果良好，才有资格在实验室进行动物和人体的进一步实验。在候选药物对各种细胞的药理作用和毒性试验中，胚胎干细胞提供了对新药的药理、药效、毒理及药代等研究的细胞水平的研究手段，大大减少了药物检测所需动物的数量，降低了成本。另外，由于胚胎干细胞类似于早期胚胎的细胞，它们有可能用来揭示哪些药物干扰胎儿发育和引起出生缺陷。人胚胎干细胞还可以用于其它用途。由于这类细胞本质上可以无限量地产生人体细胞，它们对于旨在发现稀有人蛋白的研究计划理应有用。国际上许多制药公司、学者都瞄准了这一重要的研究领域。近年来，大量实验研究表明多种中药对胚胎干细胞的定向分化有调控作用，这些发现不仅为干细胞的定向分化开辟了新的途径，而且对于中药作用机制的研究、中药新药的研制开发、某些疑难疾病防治水平的提高等都具有重要意义。
