1、植 物 生 理 学 研 究 法 （ 设 计 实 验 方 案 、 实 验 报 告 、 课 程 论 文 ）专业年级 姓 名 学 号 任课教师 开课时间 1生命科学学院植物生理与分子生物学实验室 植 物 生 理 学 研 究 法 (课 程 实 习 )盐胁迫下钙对春小麦的生理效应 目 录一、实验设计方案 2二、实验预习报告 4实验一 小麦抗逆性的鉴定（电导仪法） 4实验二 小麦 SOD活性测定（NBT 法） 5实验三 小麦 POD活性测定（愈创木酚法） 7实验四 小麦组织中可溶性蛋白含量的测定（Folin-酚试剂法）8实验五 小麦叶绿素含量测定（分光光度法） 9实验六 小麦脯氨酸含量测定（茚三酮试剂显色
2、法） 112实验七 小麦丙二醛含量测定(TBA 法) 12实验八 小麦水势测定（水势仪法） 13实验九 小麦生物量测定 14三、测定数据记录及计算 15四、课程论文 24一、 植物生理学研究法实验设计方案（10 分）论文题目 盐胁迫下钙对春小麦的生理效应小组成员得分：3选题依据及实验设计选 题 依 据 ：盐胁迫是限制作物生长发育和产量的主要环境因素之一。据统计，我国约有 2.7107hm2不同程度的盐碱地。并且由于人口增长、工业发展、不合理农业灌溉和施肥等原因, 次生盐碱化土壤面积还在继续扩大,直接造成了可用耕地面积的急剧下降, 严重威胁着我国的粮食安全。在人口不断增多、 耕地面积不断减少的现
3、实压力下, 如何利用大面积的盐碱地发展粮食生产, 是迫切需要解决的重大课题。小麦是我国主要的粮食作物之一, 在保障国家粮食安全方面发挥着巨大的作用。而小麦的抗盐能力相对较弱, 特别是在幼苗期、 拔节- 孕穗期容易引起盐害。严重限制了小麦产量的进一步提高。探讨小麦抗盐机理与调控技术对于提高小麦综合生产能力、 保障我国粮食安全和促进生态环境保护均有重要意义。盐碱环境是作物生长和产量提高的重要限制因子，主要影响作物的正常生长发育，并且对作物的光合作用有着严重的抑制作用，高盐碱环境也影响作物水分的吸收和细胞膜的通透性。钙是植物必需的一种矿质营养元素，它对维持细胞壁、细胞膜以及膜结合蛋白的稳定性，调节无
4、机离子运输，以及作为细胞内生理生化反应的第二信使偶联外信号，调控多种酶活性等都具有重要的作用。近年来的研究表明，钙能提高植物织或细胞的多种抗性，如抗冷性抗旱性抗热性抗盐性和抗多种矿质元素毒害胁迫等。本文研究了外源钙对盐胁迫下小麦幼苗各相关生理性状的影响，探讨钙与小麦耐盐性机制之间的关系，以期为耐盐小麦品种的选育以及相关课题的研究提供理论依据和技术支持。实验设计：种子用 0.1 %的 HgCl2消毒 10min，自来水充分冲洗，然后用蒸馏水浸种 24h，播种于盛有石英砂的长方形盘子中，用完全营养液培养。在温室的自然光照下生长，每 4d换 1次完全营养液。 选取生长一致的三叶一心期的幼苗，转移到
5、1 L 塑料烧杯（外裹遮光黑布）中，每杯植苗 4 株。每 4d换一次完全营养液，待主茎第 6叶全展后开始处理分别用：低盐胁迫(150mmol/LNaCl)、低盐胁迫+4mmol/L Ca2+、低盐胁迫+10mmol/L Ca2+、 高盐胁迫(300mmol/LNaCl)、高盐胁迫+4mmol/LCa2+、高盐胁迫+10mmol/LCa2+, 以无 NaCl胁迫的小麦为对照。4d 换一次营养液，待主茎第 6叶全展后开始处理。测量不同条件下处理小麦的抗逆性、SOD 活性、POD 活性、组织中可溶性蛋白含量、叶绿素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、生物量（鲜重、叶长、根长、干重） 。每个指标的测定进行
6、3 个重复。参考文献：1李彩虹,张维军,王毅等. 盐胁迫条件下钙对春小麦的生理效应J. 宁夏农林科技,2010,(6).2朱晓军,杨劲松,梁永超等. 盐胁迫下钙对水稻幼苗光合作用及相关生理特性的影响J. 中国农业科学,2004,(10).3陈武,陈珈. 盐胁迫对玉米根尖质膜上受钙激活的蛋白激酶的影响J. 植物生理学报,1998,(4).4蔡妙珍，罗安程，林咸永，等.Ca2+ 对过量 Fe2+胁迫下水稻保护酶活性及膜脂过氧化的影响.作物学报，2003，29(3)：447- 451.5李明，王根轩.干旱胁迫对甘草幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响J.生态学报，2002，22(4)：503- 50
7、7实验一 小麦抗逆性的鉴定（电导仪法）实验二 小麦 SOD 活性测定（NBT 法）实验三 小麦 POD 活性测定（愈创木酚法）需要测定的生理指实验四 小麦组织中可溶性蛋白含量的测定（Folin- 酚试剂法）4实验五 小麦叶绿素含量测定（分光光度法）实验六 小麦脯氨酸含量测定（茚三酮试剂显色法）实验七 小麦丙二醛含量测定(TBA 法)实验八 小麦水势测定（露点水势仪法）标及方法实验九 小麦生物量（鲜重、叶长、根长、干重）测定指导老师对实验设计方案的意见：指导老师签名： 年 月 日二、生理指标预习报告实验一 小麦抗逆性的鉴定（电导仪法）（一） 原理：逆境（高温或低温）伤害原生质体结构，质膜透性增加
8、，细胞内含物（无机盐）不同程度外渗，使得外液电导度增大（伤害越重，外渗物越多，电导度的增加越大） ，故可用电导仪法测5定外液的电导度增加值而得知膜的伤害程度。（二） 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）（三） 仪器设备：真空抽滤设备、电导仪、恒温水浴锅、试管架、普通具塞、10ml 移液管、打孔器、镊子、滤纸等。（四） 试剂配制：无离子水（五） 实验步骤及注意事项：1、清洗用具：实验所用的玻璃器皿用洗衣粉洗 自来水冲洗干净 无离子水润洗 倒置在试管架上备用2、材料准备：从各种处理的叶片中选择大小，厚度相对一致发的叶片 分别用自来水冲洗除去表面的污物 再用无离子水清洗 滤纸轻轻吸干表
9、面的水分3、将正常及不同温度处理叶小片分别放入普通试管中 每个处理做两个重复管，每管放入 15 片小叶片中4、叶片抽气，水分交换、测定电导度正常叶片 高盐胁迫 高盐胁迫+钙 低盐胁迫 低盐胁迫+钙空白叶片小块 0 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15无离子水（ml）15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15真空抽气时间抽气 10 分钟水分交换时间水分交换 10 分钟测定初电导值杀死细胞沸水浴 10 分钟测定终电导值相对电导率伤害率注意事项：1、所用的各种处理叶片叶龄要一致2、整个过程中，叶片接触的用具必须绝对洁净，也不要用手接触叶片3、抽气要使叶片下
10、沉才能与水分进行充分交换4、CO2 在水中的溶解度较高，测定电导时要防止 CO2 气源和呼出的 CO2 进入试管，以免影6响结果的准确性（六） 结果计算公式：1、 相对电导度=初电导值空白电导值/终电导值空白电导值逆境叶片的相对电导度正常叶片的相对电导度2、 伤害率（%）=1正常叶片的相对电导度（七） 参考文献：1. 西北农业大学植物生理生化教研室编植物生理学实验指导西安：陕西科学技术出版社。1987实验二 小麦 SOD 活性测定（NBT 法）(一) 原理：SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性
11、大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm处有最大吸收。而 SOD 可清除 O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活力单位定义为将 NBT 的还原抑制到对照一半（50）时所用的酶量。 (二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）(三) 仪器设备：、高速台式离心机、分光光度计、微量进样器、荧光灯（反应试管处照度为 4000Lx） 、试管(四) 试剂配制：1、提取介质：50mmol/L（pH7.8） 磷酸缓冲液(内含 1
12、%不可溶聚乙烯咯烷酮)2、反应介质：50mmol/L (内含 77.1umol/硝基四唑蓝， ，13.37mmol/L蛋氨酸 3、80.2 umol/L 核黄素溶液：用含有 0.1mmol/LEDTA（pH7.8） 磷酸缓冲液配 44、SOD 反应混合液： 3.9ml 反应介质+0.1ml80.2umol/L 核黄素溶液(五) 实验步骤及注意事项：1、酶液的提取将小麦叶片剪细 混合均匀 称 0.5g 于预冷的研钵中，加入 2ml 预冷的提取介质及少量的石英砂 研磨成匀浆 再加入 4ml 缓冲液，研磨均匀后将均浆液倒入聚乙烯离心管 低温（04 度） ，4000g离心 15min 上清液即为酶液，
13、将上清液倒入离心管 ，用于 SOD 活性测定。2、SOD 活性测定测定管 对照 对照7试剂 正常 高盐胁迫 高盐胁迫 低盐胁迫 低盐胁迫 管 管（参比管酶提取液100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul 提取介质 100ul 100ulSOD反应混合液4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 4ml光照培养箱照光管3000LX 光照下 10min F 放暗处560nm比色OD 值注意事项 ：1.核黄素产生 O2- ，NBT 还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严
14、格控制光照的强度和时间。 2.植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP） ，尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。 3.测定 SOD 活性时加入的酶量，以能抑制反应的 50为佳。(六) 结果计算公式： VT-总酶液量（ml ）Vs-所用酶液量（50ul）W-叶片鲜重 （g） Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度 AE-样品管吸光度(七) 参考文献：1. 李合生主编.植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社,2000 年 07 月第 1 版.实验三 小麦 POD 活性测定（愈创木酚法）8(一) 原理：过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此
15、化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2 可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的 4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。(二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）(三) 仪器设备：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器(四) 试剂配制：愈创木酚、30%H2O2、0.2mol/L 磷酸缓冲液（PH7.8） 、0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0， ）反应混合液100mmol/L 磷酸缓冲溶液（ PH6.0）50ml，加入愈创木酚
16、 28l ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H2O2 19l ，混合均匀，保存于冰箱中。(五) 实验步骤及注意事项：1、粗酶液的提取：称取小麦叶 0.5g，加磷酸缓冲液（7.8）5ml （分几次加入） ，于研钵中研磨成匀浆，以4000g 离心 15min，收集上清液于冷处（冰箱 4 度保存） 。 2、酶活性的测定：一个试管加反应混合液 3ml，磷酸缓冲液（ 7.8） 1ml ，作为校零对照，另外加入反应混合液 3ml，上述酶液 1ml（龙麦 26 酶液稀释 10 倍，克旱 16 酶液稀释 15 倍） ，立即开启秒表计时，于4
17、70nm 测 OD 值，每隔 15 秒读 1 次值，读 45 秒，以为每 15 秒钟 OD 变化值测酶活性的大小，以OD/min.mg 蛋白质表示。注意事项：(1)、酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2 要在反应开始前加，不能直接加入。(六) 结果计算公式：过氧化物酶活性u/(g.min)= 式中：A470反应时间内吸光度的变化。 W植物鲜重，g。 VT 提取酶液总体积，mL。Vs 测定时取用酶液体积 ,mL。 t反应时间，min。(七) 参考文献：1. 西北农业大学植物生理生化教研室编植物生理学实验指导西安：陕西科学技术出版社。1987实验四 小麦组织中可溶性蛋白含量的测定（F
18、olin-酚试剂法）(一) 原理：9斐林-酚试剂法 原 理 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在 650nm 时比色测定的灵敏度比双缩脲法高 100 倍。由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为 5 l00g 蛋白质)。(二) 植物材料：小麦叶片（正常处理、高盐胁迫、低盐胁迫）(三) 仪器设备：可见分光光度计、分析天平、离心机、恒温水浴锅、
19、微量滴定管、回流冷凝装置、研钵、刻度移液管、大试管、容量瓶、烧杯、量筒、漩涡混合器等。(四) 试剂配制：1)05molL Na0H。2)斐林-酚试剂甲液：由 A、B 两种溶液组成。使用前将 A 与 B 按 50:1 的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。A 液：4碳酸钠(Na2C03)溶液与 0.2mol/L 氢氧化钠(Na0H) 溶液等体积混合。 B 液：1硫酸铜(CuS045H20)溶液与 2酒石酸钾钠溶液等体积混合。 3)斐林-酚试剂乙液4)标准蛋白质溶液：称取 25mg 牛血清蛋白，溶于 100ml 蒸馏水中，使终浓度为 250g/ml(五) 实验步骤及注意事项：（一）标准曲线的绘
20、制 （1） 取 18mm200mm 试管 7 支，1-7 编号，分别加入0mL、0.1mL、 0.2mL、0.4mL 、0.6mL、0.8mL、1.0mL 标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足 1mL，使每管含蛋白量分别为0mol/L、25mol/L、50mol/L、100mol/L、150mol/L 、200mol/L 、250mol/L。 （2） 用定量加样器给每支试管中加入 5mL 甲液，混匀，于 30下放置 10min。 （3） 再向试管中喷射加入 0.5mL 乙液，立即振荡混匀，在 30下准确保温 30min （4） 以不加标准蛋白的 1 号管为空白，在 650nm 下用 1cm 光径的比色
21、皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 (二)样品的测定 样品的提取：称取鲜样 05g，用 5mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，4000g 离心 15min，取上清液 10mL（视蛋白质含量适当稀释)于试管中，然后重复标准曲线绘制中的 24 步骤，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。(六) 结果计算公式：样品中蛋白的含量（mg/g）CVT/（Vs FW1000） 式中：C查标准曲线值（ g）VT提取液总体积（ml）FW样品鲜重（g）Vs测定时加样量（ml）(七) 参考文献：1. 文树基主编基础生物化学实验指导西安：陕西科学技术出版社，1994实验五 小麦叶绿素含量测定（分光光度法）
