1、1 革 兰 氏 染 色 法1.1原 理通 过 结 晶 紫 初 染 和 碘 液 媒 染 后 ， 在 细 胞 壁 内 形 成 了 不 溶 于 水 的 结 晶 紫 与 碘的 复 合 物 ， 革 兰 氏 阳 性 菌 由 于 其 细 胞 壁 较 厚 、 肽 聚 糖 网 层 次 较 多 且 交 联 致 密 ，故 遇 乙 醇 或 丙 酮 脱 色 处 理 时 ， 因 失 水 反 而 使 网 孔 缩 小 ， 再 加 上 它 不 含 类 脂 ， 故乙 醇 处 理 不 会 出 现 缝 隙 ， 因 此 能 把 结 晶 紫 与 碘 复 合 物 牢 牢 留 在 壁 内 ， 使 其 仍 呈紫 色 ； 而 革 兰 氏 阴 性
2、 菌 因 其 细 胞 壁 薄 、 外 膜 层 类 脂 含 量 高 、 肽 聚 糖 层 薄 且 交 联度 差 ， 在 遇 脱 色 剂 后 ， 以 类 脂 为 主 的 外 膜 迅 速 溶 解 ， 薄 而 松 散 的 肽 聚 糖 网 不 能阻 挡 结 晶 紫 与 碘 复 合 物 的 溶 出 ， 因 此 通 过 乙 醇 脱 色 后 仍 呈 无 色 ， 再 经 沙 黄 等 红色 染 料 复 染 ， 就 使 革 兰 氏 阴 性 菌 呈 红 色 。1.2步 骤革 兰 氏 染 色 法 一 般 包 括 初 染 、 媒 染 、 脱 色 、 复 染 等 四 个 步 骤 ， 具 体 操 作 方法 是 ： 1） 涂 片
3、 固 定 。 2） 草 酸 铵 结 晶 紫 染 1 分 钟 。 图 13） 自 来 水 冲 洗 。 4） 加 碘 液 覆 盖 涂 面 染 约 1 分 钟 。 5） 水 洗 ， 用 吸 水 纸 吸 去 水 分 。 6） 加 95%酒 精 数 滴 ， 并 轻 轻 摇 动 进 行 脱 色 ， 20 秒 后 水 洗 ， 吸 去 水 分 。 7） 蕃 红 染 色 液 （ 稀 ） 染 2分 钟 后 ， 自 来 水 冲 洗 。 干 燥 ， 镜 检 。2芽 孢 染 色 步骤（ 1） 取 二 支 洁 净 的 小 试 管 ， 分 别 加 入 0.2ml 无 菌 水 ， 再 往 一 管 中 加 入 1-2 接种 环
4、 的 蜡 状 芽 孢 杆 菌 的 菌 苔 ， 另 一 管 中 加 入 1-2 接 种 环 的 生 孢 梭 菌 的 菌 苔 ， 两管 各 自 充 分 混 合 成 浓 厚 的 菌 悬 液 。 （ 2） 在 菌 悬 液 中 分 别 加 入 0.2ml 苯 酚 品 红 溶 液 ， 充 分 混 合 后 ， 于 沸 水 浴 中 加热 35 分 钟 。 （ 3） 用 接 种 环 分 别 取 上 述 混 合 液 23 环 于 两 片 载 玻 片 上 ， 涂 薄 ， 风 干 后 ， 将载 玻 片 稍 倾 斜 于 烧 杯 上 ， 用 95 乙 醇 冲 洗 至 无 红 色 液 流 出 。 （ 4） 再 用 自 来
5、水 冲 洗 ， 滤 纸 吸 干 。 （ 5） 取 12接 种 环 黑 色 素 溶 液 于 涂 片 处 ， 立 即 展 开 涂 薄 ， 自 然 干 燥 后 ， 油 镜 观察 ， 在 淡 紫 灰 色 背 景 的 衬 托 下 ， 菌 体 为 白 色 ， 菌 体 内 的 芽 孢 为 红 色 。3.甲 基 红 实 验肠 杆 菌 科 各 菌 属 都 能 发 酵 葡 萄 糖 ， 在 分 解 葡 萄 糖 过 程 中 产 生 丙 酮 酸 ， 进 一步 分 解 中 ， 由 于 糖 代 谢 的 途 径 不 同 ， 可 产 生 乳 酸 ， 琥 珀 酸 、 醋 酸 和 甲 酸 等 大 量酸 性 产 物 ， 可 使 培
6、养 基 PH 值 下 降 至 pH4.5 以 下 ， 使 甲 基 红 指 示 剂 变 红 。 试 验 方 法 ： 挑 取 新 的 待 试 纯 培 养 物 少 许 ， 接 种 于 通 用 培 养 基 ， 培 养 于361 或 30（ 以 30 较 好 ） 35 天 ， 从 第 二 天 起 ， 每 日 取 培 养 液 1ml， 加 甲 基红 指 示 剂 12 滴 ， 阳 性 呈 鲜 红 色 ， 弱 阳 性 呈 淡 红 色 ， 阴 性 为 黄 色 。 迄 至 发 现 阳性 或 至 第 5 天 仍 为 阴 性 、 即 可 判 定 结 果 。 4.V-P试验4.1 原理某 些 细 菌 能 从 葡 萄 糖
7、 丙 酮 酸 乙 酰 甲 基 甲 醇 （ Acetymethyl carbinol） 2， 3-丁 烯 二 醇 （ 2， 3-bytaylene cylycol） ， 在 有 碱 存 在 时 氧化 成 二 乙 酰 ， 后 者 和 胨 中 的 胍 基 化 合 物 起 作 用 ， 产 生 粉 红 色 的 化 合 物 。4.2 方 法 同 上 法 接 种 培 养 细 菌 ， 于 2ml 培 养 液 内 加 入 6 -奈 酚 酒 精 溶 液 1ml 和40 氢 氧 化 钾 为 乙 液 0.4 毫 升 ， 摇 振 混 合 。 试 验 时 强 阳 性 者 约 于 5 分 钟 后 ， 可 产 生 粉 红 色
8、 反 应 ， 如 无 反 应 ， 应 放 在361 下 培 养 4h 再 进 行 观 察 。 （ 长 时 间 无 反 应 ， 可 置 室 温 过 夜 ） ， 次 日 不 变者 为 阴 性 。5.吲哚试验有 些 细 菌 如 大 肠 埃 希 菌 、 变 形 杆 菌 、 霍 乱 弧 菌 等 能 分 解 培 养 基 中 的 色 氨酸 生 成 吲 哚 （ 靛 基 质 ） ， 经 与 试 剂 中 的 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲 醛 作 用 ， 生 成 玫 瑰 吲哚 而 呈 红 色 ， 是 为 吲 哚 试 验 阳 性 。步 骤（1）培养基：蛋白胨水培养基。 （2）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于 35培养 2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。 （3）结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。 6糖或醇类发酵试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置 361.0C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
