1、三角帆蚌珍珠层呈色机理探讨实验设计一、预备实验计划1、 总类胡萝卜素的提取方法及效率2、 利用 -胡萝卜素为标准品制备标线，测定类胡萝卜素的总量3、 HPLC 测定样品类胡萝卜素的种类及含量4、 样品中微量元素的测定及比较二、实验总体步骤1、 样品来源选择来源相同（同一水域）的白色、紫色、粉色三角帆蚌珍珠层（外套膜边缘部）样品、紫踵劈蚌珍珠层。2、 样品前处理用次氯酸钠（5%）处理 10 分钟（？） ，去除贝壳表面角质层和棱柱层（？） ；注意浸泡时间及效果。3、 珍珠层的粉碎待白色、紫色、粉色三角帆蚌珍珠层、紫踵劈蚌珍珠风干后，用粉碎机粉碎成粉（应注意粉碎时的温度，防止类胡萝卜素的降解） 。4
2、、 总类胡萝卜素的提取用丙酮：石油醚（1：1） （丙酮主要有利于提取极性较小或非极性的如 -胡萝卜素；石油醚主要有利于提取极性的类胡萝卜素） 按料液比 1：5 在棕色瓶中萃取，同时加入001丁基羟基甲苯抗氧化，离心将上清液，反复萃取至萃取液无色，合并上清，真空干燥后，用丙酮定溶至 25ml 棕色容量瓶中，最好在当日测定或低温保存。5、 类胡萝卜素的总量测定以 -胡萝卜素为标准品制定标准曲线，分光光度计法（最大吸光度处的波长，448nm左右） ，测定样品中类胡萝卜素的总量。6、 类胡萝卜素的组成及含量检测样品过滤后，利用 HPLC（外标法和内标法）检测萃取样品中类胡萝卜素的组成及含量。7、 微量
3、元素的测定主要检测哪几种微量元素。8、探讨珍珠层呈色与类胡萝卜素、微量元素的关系Algae, the main carotenoid producers in the aquatic environment, depend on the season, so the carotenoid contents of shrimps change, also depending on the seasons.三角帆蚌不同组织中类胡萝卜素的含量比较分析一、开题报告主要内容：1. 本研究的意义：分析类胡萝卜素在不同组织中积累的情况；同时阐述珍珠层颜色与类胡萝卜素含量的关系。2. 国内外研究现状：综述贝类
4、（主要是海水贝类、淡水贝类）软组织中类胡萝卜素的含量、种类的研究概况。 （如果内容少，可以扩大到水产品，如虾、鱼组织中的类胡萝卜素分类研究。 ）3. 技术路线比较简单：制定标准曲线；有机容积萃取软组织中类胡萝卜素，分光光度计比色；比较分析。二、主要实验步骤：1、 选择来自同来源的三角帆蚌，清水中暂养 2d 让消化道排空。2、 用-胡萝卜素标准品，分光光度法比色（480nm） ，制定标准曲线，建立回归方程。 （需要摸索配置合适的浓度梯度，参考长旋螺（the spindle shell）肌肉中含量在 0.045mg/g） 。3、 测量壳长、壳高、壳宽、湿重；解剖，辨别不同珍珠层颜色，分别取外套膜（
5、外套膜按不同颜色珍珠层部位分别取样） 、鳃丝、斧足、闭壳肌、性腺；每种样品取重复 6 个以上，按重量体积比（1g：5ml）添加丙酮与石油醚（1：1）的混合液，组织研磨后 4下静置过夜，离心取上清液，再加 5ml 丙酮与石油醚混合液萃取，反复萃取至无色，合并上清液，480nm 测定吸光度。4、 计算不同组织类胡萝卜素含量，用统计软件分析组织差异，不同颜色珍珠层外套膜的类胡萝卜素含量。许多研究者对三角帆蚌不同颜色珍珠的有机相进行了拉曼光谱研究。一、类胡萝卜素的相关资料叶黄素（1utein），玉米黄素（zeaxanthin），番茄红素（lycopene ），-胡萝卜素（-caroten）虾青素 As
6、taxanthin 1、化学性质类胡萝素是一类异戊二烯化合物。由尾尾相连的 2 个二十碳单位构成四十碳的分子母体碳架，并从中衍生出许多不同的化合物。类胡萝素分子最显著的结构特征是分子中含有由不同数目的双键或单键的长链所构成的中央分子区域，形成 1 个共轭体系。多数类胡萝素分子中带有 9l 3 个共轭双键由于 C=C 双键的存在，使每个类胡萝素分可有多种同份异构体。2、主要种类类胡萝卜素(carotenoids)是天然色素多烯色素的总称，广泛存在于动、植物和微生物界，能在水产动物体内转化并沉积。其按结构可分为胡萝卜素类和叶黄素类。前者由碳和氢组成，属于烃类色素，如胡萝卜素；后者属于含氧色素，是烃
7、类色素的衍生物，含有羟基、羰基、甲氧基等，如虾青素、角黄素等。其中虾青素，是动物界分布最广泛的一种叶黄素，尤其在海洋甲壳类动物和鱼类体内是主要的类胡萝卜素。胡萝卜素类的色素有 -胡萝卜素、-胡萝卜索、 -胡萝卜素，均是维生素 A 源，在体内可转化为维生素 A，其对鱼体的着色作用受其转化率的影响，一般认为着色效果不明显(于昱， 2004)。叶黄素是胡萝卜素的含氧衍生物，这类化合物无论是天然来源还是人工合成来源都能被吸收，最终沉积在水产动物组织中。在天然饲料中，类胡萝卜素有顺式和反式两种构型，由于反式构型胡萝素具有较红的色泽和较高的稳定性，因此反式较顺式有好的着色效果。鱼类的体色主要依赖于皮肤中色
8、素细胞的存在，并受神经和内分泌系统的控制。这些细胞中主要含有 4 类色素，即类胡萝卜素、黑色素、喋啶和嘌呤。蝶啶是水溶性化合物，象类胡萝卜素一样，产生亮色，但与后者相比较，成色作用较小；嘌呤化合物中，以鸟嘌呤为主，大多数鱼类的银色腹部皮肤中都能发现大量鸟嘌呤。这些基础化合物能与其它化合物如蛋白质结合，在鱼类中产生蓝色、紫罗兰色和绿色。 （胡梦红，绿色饲用着色剂一类胡萝卜素在水产中的应用，2007）3、关于动物-胡萝卜素来自动物体壳的-胡萝卜素，按化学结构称之为： 3-3-二羟基-4-4- 二酮-胡萝卜素。它在化学结构上具有活跃的功能基，有更强的氧化还原能力。它既有植物胡萝卜素的基本化学功能结构
9、，具有叶黄素、玉米胡萝卜素、番茄类胡萝卜素、木瓜黄素等的功能基，而它的 O-2 则有生物黄酮的某些特性。动物-胡萝卜素，在动物体壳内是与蛋白质结合在一起的。日晒、加热等可使动物-胡萝卜素与蛋白质分离。它溶于脂肪，在吡啶溶液中的溶解度更大使用 3-甲基吡啶提取动物 -胡萝卜素是较好的方法。 （王维亮，动物- 胡萝卜素值得开发， 2010）5、类胡萝卜素的有机溶剂的提取方法极性大的含氧类胡萝卜素主要使用极性强的有机试剂(丙酮等) ，极性小的类胡萝卜素主要使用极性弱的有机溶剂( 石油醚等) 另外，也有用甲醇一乙醚 【3】 、甲醇一氯仿【4】 、甲醇一丙酮一正己烷【5】作为溶剂的但是在众多溶剂中，没有
10、一种溶剂能适合所有样品中的类胡萝卜素。 （姬小明，类胡萝素的提取及分离方法研究进展，2008）6、类胡萝卜素的分离方法高效液相色谱是目前应用最广也最适用于天然色素分离方法，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少等优点，常用于类胡萝b素的分析和半制备【15】徐响等【16】用Zorbax SB C18 。柱分离，以丙酮一水为流动相梯度洗脱，共分离出14种游离的类胡萝卜素。Chert等【17】以Vydac 201 TP54C埽柱为固定相，采用组成为甲醇一乙腈(体积比95：5或10：90)的二元流动相或乙腈一甲醇一二氯甲烷(体积比75：15：10)三元流动相，较好地分离了胡萝卜素的4种异构体。对于一些
11、结构相似、比较难于分离的类胡萝素，也可采用分子蒸馏、气相色谱、色谱一质谱联用等方法进行分离纯化处理刘良忠等【18】采用色谱一质谱技术分离鉴定了天然红心鸭蛋蛋黄中红色素的分子组成和结构，证实红心蛋中的红色素为一种含羰基的类胡萝卜素即紫杉紫素。（姬小明，类胡萝素的提取及分离方法研究进展，2008）二、类胡萝卜素与珍珠呈色的相关研究1、颜色是评价珍珠质量的一个重要因素。中国淡水养殖珍珠的颜色包括多种系列和许多过渡性颜色，其中浅色调系列占有较大的比重。目前，对珍珠颜色的具体描述还没有统一标准。据报道【1】，珍珠的色素成分主要包括：色素(卟啉、金属卟啉、类叶红素)、金属离子(Mn和Fe的离子)、铁肽配合
12、物、蛋白质、糖衍生物、氨基糖等【1】，其中大多数为有机物。关于无机金属离子如何使珍珠致色以及珍珠中有机物与珍珠颜色的关系，目前还不十分清楚。主要结论：（1）淡水养殖珍珠的颜色主要起因于珍珠中的有机色素，珍珠颜色的变化取决于珍珠中有机色素含量的多少。（2）对于浅色系列的珍珠，颜色越白，其R值越低，R值的测量可试作为评价珍珠白度的定量指标。（高岩，淡水养殖珍珠的颜色与拉曼光谱的关系，2001）2、无光珍珠可能是由于蛋白质分泌不足造成文石晶体的不规则排列而形成；有色珍珠的颜色则可能是在蛋白质正常分泌基础上而形成。蛋白质的正常分泌可能在一定程度上有利于进一步分泌合成有机色素或鳌合金属离子而呈色。主要结
13、论：（1）养殖珍珠的有机质含量与颜色深浅相关, 深色珠高于浅色珠, 光泽强的白色淡水珍珠高于无光珠。（2）随有色珍珠的颜色加深, 其内部有机质与文石排列结构更加规整有序, 深色有机层的镜面反射作用增强, 晕彩更易显现, 光泽相应增强.（李 耿，淡水养殖珍珠的光泽、颜色与有机质关系初探，2007）3、 关于珍珠层中可能存在类胡萝素的报道仅见Urmos等【4】 的论文，他在一天然珍珠中探测到较弱的类胡萝素的拉曼峰。本文首次报道在人工养殖珍珠及贝壳珍珠层中存在较强的类胡萝素拉曼峰，并对其在同一贝壳不同位置的相对含量进行了较详细的研究。主要结论：珍珠层中非文石矿物引起的拉曼峰1 132cm -1和1
14、527cm -1 为典型的全反式共轭双键的类胡萝素引起【4,7-13】。该两峰的相对强度与珍珠层的颜色密切相关，即在深色样品中相对强度大，浅色样品中相对较弱或没有；该两峰的相对强度与珍珠层的位置密切相关，在贝壳后端其相对强度较大，壳前端及壳顶位置弱或无，从壳后端至壳顶，其相对强度呈现明显的规律性变化，即由大至小变化。实验结果表明：类胡萝素的浓度与珍珠及珍珠层的颜色密切相关，可能是珍珠呈色的重要原因之一。因此，该成果为人工养殖珍珠改色，以进一步提高珍珠质量提供了科学依据。在同一贝壳中不同位置的类胡萝素相对浓度的变化表明其可能与贝壳的生物矿化作用有密切的关系。由于类胡萝素分子共轭双键系统中的电子和
15、振动的耦合效应，极低的浓度即可引起很强的拉曼谱带【15】，故单靠拉曼光谱不能完全准确鉴定出其完整的分子结构和其在样品中的绝对浓度，下一步的工作包括采用溶剂将类胡萝素从珍珠层或珍珠中萃取出来，再用液相色谱及其它谱学方法等进行研究，以获得更完整的数据。（张刚生，三角帆蚌贝壳珍珠层中类胡萝素的激光拉曼光谱研究，2001）4、美国：虾青素作为防止脑血栓形成药物完成临床前研究来源：天然虾青素官网 发布日期：2010-08-05-湖北雅仕达生物技术有限公司 李昌军（译）血栓是血液在血管内壁剥落处或修补处表面所形成的小血块，血块脱落后随着血液循环常常会堵塞脑动脉，使部分脑组织失去血液、氧气及养分供应，导致梗
16、塞部位脑组织神经功能丧失。这个过程就叫脑中风，对高血压患者而言，脑中风是最大的威胁。对缺血性脑中风的患者来说，脑血栓是最大的威胁。现在医院对中风的治疗，常常用静脉内注射纤维蛋白溶酶原激活质(tPA)如链激酶、尿激酶等来消溶血栓。但是无论什么形式的治疗，人体再次形成血栓和动脉再次梗塞的几率都很高，在最初的30天内，发生率约为37%，而治疗后的首次动脉再次梗塞一般发生在治疗后的7-10天内。现在有证据表明氧化应激（主要是低密度脂蛋白LDL氧化为Ox-LDL）和及Ox-LDL引发的炎症能引起异常血栓形成，而虾青素(ASTA)具有强大的抗氧化功能和抗炎功能，提示虾青素是治疗血栓潜在药物。而美国Card
17、ax 制药商在犬科模式动物中开展的这方面研究，取得了满意的效果。在动物试验中，用虾青素处理动物能明显降低再次形成血栓和再次闭塞的几率，而不影响凝血功能。并已经完成临床前的所有研究工作。并已经向美国FDA提交了临床研究的申请。图1：类胡萝卜素与细胞膜的相互作用，非极性类胡萝卜素（如-胡萝卜素）使细胞膜结构紊乱，极性类胡萝卜素（如虾青素）能保持细胞膜的结构。虾青素是一种类胡萝卜素，其抗氧化活性是天然维生素E的1000倍，天然-胡萝卜素的10倍。07年McNulty的X- 射线衍射技术清楚展现了几种抗氧化剂在细胞膜内的定位（如上图所示） ，研究显示虾青素能保持细胞膜的结构，并且表现了超强的抗氧化活性
18、，而-胡萝卜素、番茄红素则干扰了细胞膜的正常结构（上图左） ，表现出极低的抗氧化活性，这些抗氧化剂在细胞膜内的区别很容易解释非极性抗氧化剂如-胡萝卜素、维生素E、维生素C等为什么没有取得临床成功的原因。安全是药物的关键。现在很多抗炎药物，通常特异性作用于炎症信号传导途径的某一种酶或受体，而此受体同时还可能是另外信号途径的关键组成部分，当人体长期服用此药，此信号传导途径不再有效，从而导致药物副作用的产生。而虾青素是一个安全性很高的药物，到目前为止还没有证据显示虾青素能干扰其它人体正常的受体途径。除此之外虾青素还具有：1，定位在细胞膜 线粒体 和核膜内2，有效地淬灭炎症的引发者 活性氧（ROS）和
19、活性氮（RNS）3，在模型动物上表现出抗感染的功能此文参考http:/ HP, Byun J, Lockwood SF, Jacob RF, Mason RP, 2007. Differential effects of carotenoids on lipid peroxidation due to membrane interactions: X-ray diffraction analysis Biochemica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1768(1); 167-174相关文献： 1、常练脑筋急转弯加服虾青素可有效减缓脑萎缩和预防老年性痴呆 2
20、、虾青素：可有效预防再次脑梗塞 3、美国立卫生研究院:虾青素能显著减轻【脑梗塞】带来的伤害 4、名古屋大学：【虾青素】将成为预防和延缓【帕金森病】进程的首选保健品 5、脑梗塞症状及预防天然虾青素官网e- 版权所有 ,本文来源于http:/www.e- （邓燕华，控制我国珍珠质量的因素，2001年）结合珍珠漂白前后横切面特征及微量元素变化可知，漂白过程中，Fe，Mn，Cu等致色离子大部分随有机碳一起除去，部分残留在中心或中部或边缘圈层中说明它们与有机碳关系十化密切。部分仅以离子状态被有机质吸附，因而易于除去，部分则与有机物形成化学性质稳定的卟啉体，并表现出特有的活性，这种活性一方面表现在参与生物
21、机体的生命活动，同时金属卟啉体本身就是色素团，有的还具有荧光性，所以珍珠的色彩不仅决定于致色离子本身，也决定于这些离子的综合作用和金属卟啉体的综合作用。 （邓燕华，控制我国珍珠质量的因素，2001年）珍珠质量（无机成分对珍珠质量的影响）珍珠的无机矿物成分绝不象我国传统观念(李兆聪1990；栾秉敖1991)所述，仅由文石组成，也不是如Rort webster(199o)所说：“宝石级珍珠中碳酸钙实际是常由文石组成，仅仅有些淡水珠中发现方解石柱体”。海水养殖珠中除含文石外尚有1045的方解石一般说来珍珠质量愈好方解石含量愈少；优质有色淡水珠由文石单一相组成，仅在白色珠中发现方解石(2 左右)；无光珠中除含文石外还含27的球文石，这说明珍珠的无机矿物成分是影响珍珠质量的重要因素，粗粒疏状方解石和球文石的存在太大影响珍珠的光泽且不能用漂白方法予以优化改善。（邓燕华，控制我国珍珠质量的因素，2001年）优质珠为单一的文石结晶; 无光珠有通体无光与部分无光2种, 或全部由球文石组成, 或者由球文石与文石共同结晶而成, 根据无光珠种类不同二者含量发现变化。（马红艳，浙江雷甸淡水珍珠矿物成分特征，1998年）
