1、酵母单杂分析酵母单杂交技术是体外分析 DNA 与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别 DNA 结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与 DNA 结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。【实验目的】了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。【实验原理】酵母单杂
2、交方法是根据 DNA 结合蛋白（即转录因子）与 DNA 顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA） 。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin ）上游，Pmin 启动子下游连接报告基因。进行 cDNA 融合表达文库时，编码目的转录因子的 cDNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活 Pmin 启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。cDNA 文库筛
3、选cDNA融合表达载体转录因子顺式元件 顺式元件 Pmin 报告基因基因编码产物酵母细胞表达“Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System”提供了一个简单高效的构建 cDNA 文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用 aureobasidin A 抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选发展而来，利用单杂交筛选可以对 cDNA 文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。图 2 用 Matchmaker Gold One-Hybrid System 筛选 protein-DNA 相互作用
4、的原理The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process 主要包括以下步骤：1 将已知序列（bait）克隆到 pAbAi 载体。2 pBait-AbAi 质粒转化 Y1HGold 酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成bait/reporter 酵母菌株。3 检测 Y1HGold bait 菌株 AbAir 基因的本底表达水平。4 合成 cDNA 并通过 cDNA 和 pGADT7-Rec 载体共转化酵母进行细胞内同源重组筛选 cDNA 文库。5 筛选结果的验证和分析。【实验准备】1 仪器设备微量取液器（2.5 L；20 L；50
5、 L；100 L；200 L；1000 L） 、PCR 仪、低温离心机、台式离心机、CHROMA SPINTM+TE-400 纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm 培养皿、15 cm 培养皿等。2 实验材料Y1HGold 酵母株、TOP10 大肠杆菌菌株、各种方法提取的RNA、 pGADT7-Rec 质粒和 pBait-AbAi 质粒等。3 主要试剂（1） Advantage 2 PCR 试剂盒、Easy Yeast Plasmid Isolation 试剂盒、Matchmaker Insert Che
6、ck PCR Mix 1、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2。（2） 各种基础培养基和营养缺陷培养基：minimal SD base，minimal SD agar base，YPD medium，YPD agar medium，-Leu DO supplement，-Ura DO supplement，腺苷酸（adenine） ，PEG8000，carring DNA，aureobasidin A，LB 培养基，氨苄西林。（3） NaCl 溶液（0.9% ） 、sodium acetate （3 mol/L） 、50% PEG、10LiAc（1 mol/L）
7、、10TE buffer、DTT （100 mmol/L） 、RNaseH、限制性内切酶。【实验方法】1 pBait-AbAi 载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到 pAbAi 载体 AbAir 报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的 DNA 三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于 20 bp 的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。（1） 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与 pAbAi 载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的
8、突变序列作为对照，以排除可能的假阳性） 。（2） 用 TE buffer 溶解寡核苷酸至终浓度 100 mol/L。（3） 将正向链和反向链按照 1:1 的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为 50 mol/L） 。（4） 95 C 保温 30 s，去除二级结构。（5） 72 C 保温 2 min， 37 C 保温 2 min，25 C 保温 2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。（6） 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C 冰箱备用。（7） 酶切 1 L pAbAi 载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。（8） 将退火
9、后的寡核苷酸稀释 100 倍至终浓度为 0.5 mol/L。（9） 在连接反应管中加入如下成分：pAbAi 载体（50 ng/L） 1.0 Lannealed oligonucleotide （0.5 mol/L） 1.0 L10T4 DNA ligase buffer 1.5 LBSA（10 mg/mL） 0.5 LNuclease-free H2O 10.5 LT4 DNA ligase （400 U/L） 0.5 L总体积 15 L注：如果有必要，可用 1 L nuclease-free H2O 代替寡核苷酸作为阴性对照。（10） 将反应体系室温放置连接 3 h，转化 E coli，采用
10、常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2 质粒转化酵母细胞，生成 Bait-Reporter 酵母菌株（图）图 3 Bait-Reporter 酵母菌株生成原理示意图（1） 用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 L pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi 质粒，使其在 URA3 基因处断开，纯化酶切产物。（2） 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2 的步骤用 1 l 酶切后的质粒转化 Y1HGold 酵母。（3） 稀释每个转化体系至 1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-
11、Ura 琼脂平板上。 3 d 后挑取 5 个单克隆，用 Matchmaker Insert Check PCR Mix1 进行 PCR 检测阳性克隆，用 Y1HGold 的单克隆做阴性对照。（4） 在 PCR 管中加 25 l PCR-grade H2O。（5） 用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进 PCR-grade H2O 中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止 PCR 反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。（6） 向每个管中加入 25 l Matchmaker Insert Check PCR Mix
12、，混匀，离心。每个 PCR 管中现已含有如下反应物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 lH2O/yeast 25 l总体积 50 l（7） 按下述程序进行 PCR 反应；95 C 1 min98 C 10 s55 C 30 s 30 cycles68 C 2 min（8） 取 5 l PCR 产物，用 1%的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与 AbA 基因以及 URA3 下游的 Y1HGold 基因组结合，扩增片段长约 1.4 kb。图 4 PCR 检测 pBait-AbAi 的插入情况正确的 PCR 检测结果应是：阳性对照：1.4 kb阴性对照：无条带诱饵菌株
13、：1.35 kb+insert size（9） 分别挑取 PCR 检测呈阳性的诱饵克隆和 p53-AbAi 对照克隆，在 SD/-Ura平板上划线培养。30 C 孵育 3 d 后，将平板置于 4 C 保存，即为新构建的 Y1HGoldBait/AbAi菌株和p53/AbAi对照菌株。（10） 经过长期放置后，挑取单克隆在 YPDA 液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用 1 mL 预冷培养基（100 ml 灭菌的 YPDA 与 50 ml 灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 C 保存。3 检测诱饵菌株 AbAr 基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到 pAbAi 载体中的诱饵
14、序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi 对照的最低aureobasidin A 抑制浓度为 100 ng/ml。注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株 AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的 AbA 浓度。（1） 分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用 0.9% NaCl 重悬细胞，调节 A600 到0.002（大约 2000 个细胞/100 l） 。（2） 在下述培养基上分别涂布 100 l 重悬后的菌液，30 C
15、 培养 2-3 d。SD/-UraSD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）预期结果如下所示：表 1 AbAr 基因预期本底表达结果AbA/（ng/mL） Y1HGoldp53-AbAi克隆数 Y1HGoldpBait-AbAi克隆数0 约 2000 约 2000100 0 Bait dependent150 0 Bait dependent200 0 Bait dependent（3） 在进行文库筛选时，使用 AbA 的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的
16、 AbA 浓度（高约 50-100 ng/mL） ，以彻底抑制诱饵菌株的生长。注：如果 200 ng/mL AbA 不能抑制本底表达，可以尝试提高 AbA 浓度至500-1000 ng/mL。然而，在不存在捕获物的情况下，如果 1000 ng/mL 的 AbA浓度仍无法抑制 AbAr 基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4 文库 cDNA 的合成提取试材总 RNA，进行反转录合成 cDNA。合成的 cDNA 末端具有与pGADT7-Rec 相同的酶切位点。（1） cDNA 第一链的合成准备高质量的 poly A 和 /或总
17、 RNA，用 human placenta poly A+RNA 作为阳性对照。注：RNA 的质量决定文库的质量，RNA 应为所要研究的特定时期和特定组织的 RNA。在微量离心管中加入如下反应物：RNA 模板（0.025-1.0 g poly A 和/或 0.10-2.0 g 总 RNA） 1-2 lCDS III（oligo-dT ）or CDS III/6（random ）引物 1.0 lDeionized H2O （使总体积达到 4.0 l） 1-2 l总体积 4.0 l在另外一支管中加入对照 cDNA 反应物，即 RNA 使用 1 l（1 g）control poly A+RNA。72
18、 C 孵育 2 min。冰上放置 2 min，轻轻混匀，立即加入步骤中的试剂。每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5first-strand buffer 2.0 lDTT（100 mmol/L） 1.0 ldNTP mixture（10 mmol/L） 1.0 lSMART M-MLV RT 1.0 l总体积 5.0 l注：步骤中的试剂可在步骤之前加好置于冰上。此步是 cDNA 合成的起始关键步骤，变性后的 RNA/引物 mix 冰上放置的时间不应超过 2 min。如果用的是 CDS III/6 随机引物，25-30 C 保温 10 min。如果用的是 CDS III引物，省略此步，进行步
19、骤。42 C 保温 10 min。加入 1 l SMART III oligo，充分混合，42 C 保温 1 h。75 C 保温 10 min 终止第一链的合成。降至室温，加入 1 l RNase H（2 U） 。11 37 C 保温 20 min。12 cDNA 第一链合成产物应于-20 C 保存，可用 3 个月。（2）long distance PCR （LD-PCR）合成 cDNA 第二链根据合成 cDNA 第一链时使用的 RNA 量，下表给出了进行 LD-PCR 时最佳的热循环数。使用的热循环数越少，非特异性 PCR 产物越少。表 2 RNA 量与最佳热循环数总 RNA/g Poly
20、A+RNA/g 循环数1.0-2.0 0.5-1.0 15-200.5-1.0 0.25-0.5 20-220.25-0.5 0.125-0.25 22-240.05-0.25 0.025-0.125 24-26LD-PCR 反应混合物中加入如下物质（每个样品做 2 个 100 l 体系，对照做1 个 100 l 体系）：First-strand cDNA （from protocol A） 2 lDeionized H2O 70 l10advantage 2 PCR buffer 10 l50dNTP mix 2 l5RACE 引物 2 l3RACE 引物 2 lMelting soluti
21、on 10 l50advantage 2 polymerase mix 2 l总体积 100 l按照以下程序进行 PCR 反应：1 个循环 95 C 30 sX 个循环 95 C 10 s68 C 6 min1 个循环 68 C 5 min取 7 l PCR 产物用 1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用 1 kb DNA ladder。（2） 使用 CHROMA SPIN+TE-400 柱纯化 ds cDNA为每一个要纯化的 cDNA 样品准备一个 CHROMA SPIN+TE-400 柱。将纯化柱翻转几次，充分悬浮 gel matrix。移去柱的顶盖和底盖，将柱放入 2 ml 收集管中。将柱
22、放入离心机，700 g 离心 5 min 以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，把 cDNA 加到 gel matrix 的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段 cDNA。700 g 离心 5 min，纯化的 cDNA 收集到管中。将两个纯化的 cDNA 样品合并到一管，测量体积。加入 1/10 体积 3 mol/L 醋酸钠（pH5.3） ，混匀。加入 2.5 倍体积无水乙醇。-20 C 冰冻 1 h。室温，14000 r/min 离心 20 min。小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。14000 r/min 瞬时离心，去除残留上清液。
23、沉淀于空气中干燥 10 min。注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。用 20 l 灭菌去离子水溶解沉淀，此 cDNA 可用来进行同源重组构建文库。纯化后的 cDNA 用 1%的琼脂糖电泳检测。5 构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA 融合表达文库的构建及筛选）（1） 构建并在 SD/-Leu/AbA 培养基上检测 Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA 的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。（2） 按 SMART technology 步骤合成 ds cDNA，其浓度为 2-5 g/20 L。（3） 用 Yeast Transformation Sy
24、stem 2 的方法转化酵母，在转化体系中加入如下物质：cDNA 文库转化 Y1HGoldBait/AbAi菌株20 l SMART-amplified ds cDNA （2-5 g）6 l pGADT7-Rec， （Sma I-linearized） （3 g）Y1HGold 53/AbAi 的转化5 l p53 fragment （125 g）2 l pGADT7-Rec， （SmaI-linearized） （1 g）将转化体系分别稀释至 1/10、1/100、1/1000、1/10000 后，各取 100 l 涂100 mm 平板。文库转化涂 SD/-Leu 和 SD/-Leu/AbA
25、 平板，对照 p53 转化涂 SD/-Leu 和SD/-Leu/AbA200 平板。（4） 将剩余的所有文库转化混合物（约 15 ml）涂在 150 mm SD/-Leu/AbA 平板上，每板涂 150 l。（5） 倒置培养 3-5 d。（6） 3-5 d 后，通过统计 SD/-Leu 100 mm 平板上的克隆数目来计算筛选的克隆数。注：所筛选的克隆数至少应该达到 1 百万，否则会降低筛选到目的产物的可能性。筛选的克隆数=cfu/ml on SD/-Leudilution factorresuspension volume（15ml）例如：resuspension volume=15 mlP
26、lating volume=100 l250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesThe number of clones screened=250 cfu/0.1 ml10015 ml=3.75 million（7） 预期结果阳性对照试验：SD/-Leu 和 SD/-Leu/AbA200 培养基上的克隆数相近。文库筛选试验：根据 SD/-Leu 平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于 1 百万且 SD/-Leu/AbA 平板上的克隆数远远少于 1 百万，阳性克隆数目取决于诱饵序列。6 阳性克隆的鉴定及 cDNA 质
27、粒的分离（1） 阳性克隆重新划线培养，进行表型确认将阳性克隆在 SD/-Leu/AbA 培养基上重新划线，产生新的单克隆。2-4 d 后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。（2） 酵母克隆 PCR 消除重复克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 （Cat.No.630497）进行 PCR，对插入到 pGADT7 载体中的 cDNA 片段进行扩增。PCR 管中加入以下反应物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 lH2O/Yeast 25 l总体积 50 l按下述程序进行 PCR 反应：94 C 1 min98 C 10 s6
28、8 C 3 minPCR 产物在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。产物不是单一的条带很正常，这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用 Alu I 或 Hae III或者其它常用的限制性内切酶消化 PCR 产物，产物用 2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取 50 个克隆进行 PCR 分析。为了快速验证克隆，PCR 产物可经过纯化后用 T7 引物测序。（3） 阳性 cDNA 质粒的分离获取酵母中文库质粒的分开。与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着阳性克隆里不只含有能激活 AbAr 报告基因
29、的质粒，还可能含有一种或多种不表达相互作用蛋白的 cDNA 质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在 SD/-Leu/AbA 培养基上重复涂布 2-3 次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。从酵母中获取阳性 cDNA 质粒为了鉴定阳性互作相关的基因，用 Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （Cat.No.630467）从酵母中获取阳性质粒。转化 E coli 并分离阳性 cDNA 质粒用常用的克隆菌株对阳性 cDNA 质粒进行克隆，用 LB 加 1
30、00 g/ml ampicillin进行选择。（4） 鉴别阳性和假阳性互作酵母单杂交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活 AbAr 报告基因所必需的。假阳性：在诱饵序列突变的情况下，诱饵仍可以激活 AbAr 报告基因。用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认：用 Yeastmaker Transformation System 2 的试剂和 small-scale 转化程序将 100 ng 获取的捕获质粒转化到 Y1HGoldBait/AbAi和 Y1HGoldMutant/AbAi菌株中。注：阳性对照和阴性对照实验应该一起进
31、行。在 SD/-Leu 和 SD/-Leu/AbA 培养基上涂 100 l 转化混合物 1/10 和 1/100 的稀释物。30 C 恒温培养 3-5 d 后，预期结果如表所示。表 3 阳性和假阳性相互作用验证结果A 阳性样品 选择培养基 2 mm 清晰的克隆酵母菌 SD/-Leu 有Y1HGold诱饵/AbAi+靶 SD/-Leu/AbA 有酵母菌 SD/-Leu 有Y1HGold突变/AbAi+靶 SD/-Leu/AbA 无（或者很小）B 假阳性样品 选择培养基 2 mm 清晰的克隆酵母菌 SD/-Leu 有Y1HGold诱饵/AbAi+靶 SD/-Leu/AbA 有酵母菌 SD/-Leu
32、 有Y1HGold突变/AbAi+靶 SD/-Leu/AbA 有（5） 阳性克隆的测序分析一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入 cDNA 片段，验证与 GAL4 AD 序列融合的开放阅读框（ORF）序列，并与 GenBank、EMBL或其他数据库中的序列进行比较。【注意事项与建议】1 进行一轮酵母单杂交筛选后，得到的阳性克隆可能非常少或者非常多，在这种情况下，建议做如下处理。阳性克隆太少：检查所筛选的克隆数是否大于 1 million通过阳性对照和阴性对照检查培养基是否正常重新检测诱饵的最低 AbA 抑制浓度试着增加目的序列的拷贝数，通常目的序列的拷贝数为 3 时，试验效果最好。阳性克隆太多：检查是否使用了最佳 AbA 抑制浓度；如果使用了 100 ng/ml AbA，使用 200 ng/ml 的 AbA 浓度重新筛选通过阳性对照和阴性对照检查培养基营养缺陷是否正常可能文库中存在大量能编码与诱饵序列结合蛋白的 cDNA。可通过酵母 PCR 将其克隆分类，每一类中的代表可用来进行阳性互作分析。2 对阳性克隆进行测序之前需进行以下试验。用新鲜的选择性培养基对阳性克隆重新划线培养，进行表型确认；酵母克隆 PCR，对重复的克隆进行分类；阳性 cDNA 质粒的分离；阳性和假阳性互作的辨别。
