1、 重组质粒的连接、转化及筛选第一节 概 述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的 DNA 片段(10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒 DNA 和目的 DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源 DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源 DNA 片段和载体 DNA 的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的
2、自身环化,还可以利用遗传学手段如 互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源 DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的 DNA 片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源 DNA 片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在 PCR 扩增时，在 DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化，
3、亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体 DNA 均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种 DNA 的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体 DNA 的 5磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒 DNA 的自身环化。带 5端磷酸的外源 DNA 片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入 E. coli 受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由 DNA 聚合酶补平所致。由于平端的连
4、接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA 连接酶的浓度和外源 DNA 及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进 DNA 分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源 DNA 分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA 片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter) 使其匹配, 也可以有控制的使用 E. coli DNA 聚合酶的 klenow 大片段部分填平 3凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒 DNA 为 pBS,转化受
5、体菌为 E. coli DH5 菌株。由于 pBS 上带有 Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用 Amp 抗性筛选与 -互补现象筛选相结合的方法。 因 pBS 带有 Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有 pBS DNA 的转化子才能在含有 Amp 的 LB 平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS 上带有 - 半乳糖苷酶基因(lacZ) 的调控序列和 - 半乳糖苷酶 N 端 146 个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏 lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5
6、 菌株带有 -半乳糖苷酶 C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS 和 DH5 编码的 -半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在 pBS 和 DH5 融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 -半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫 -互补。由 -互补产生的 Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物 X-gal(5-溴-4 氯-3- 吲哚- -D- 半乳糖苷)下存在下被 IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到 pBS 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活 , 产生的氨
7、基酸片段失去 - 互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，-互补产生的 Lac+细菌由于含 -半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使 pH 下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去 -互补能力，因而不产生 - 半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体 DNA 分开。此为 - 互补现象筛选。 第二节 材料、设备及试剂 一、 材料 外源 DNA 片段: 自行制备的带限制性末端的 DNA 溶液,浓度已知; 载体 DNA: pBS 质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已
8、知; 宿主菌: E. coli DH5 ,或 JM 系列等具有 -互补能力的菌株。 二、 设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台， 微量移液枪，eppendorf 管。 三、 试剂1、连接反应缓冲液(10)：0.5mol/L TrisCl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌） ，500g/ml 牛血清清蛋白(组分 V.Sigma 产品） （可用可不用） ，10mol/L ATP（过滤灭菌） 。 2、T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。3、X-ga
9、l 储液 (20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成 20mg/ml 的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20。4、IPTG 储液(200mg/ml): 在 800l 蒸馏水中溶解 200mg IPTG 后,用蒸馏水定容至 1ml,用 0.22m 滤膜过滤除菌，分装于 eppendorf 管并储于-20。 5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar) ：取 52g 麦康凯琼脂加蒸馏水 1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至 60左右加入 Amp 储存液使终浓度为 50mg/ml，然后摇匀后涂板。 6、含 X-gal 和 IPTG 的筛选培
10、养基：在事先制备好的含 50g/ml Amp 的 LB 平板表面加 40ml X-gal储液和 4lIPTG 储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于 37下放置 3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收。7、感受态细胞制备试剂: 见第三章。 8、煮沸法快速分离质粒试剂: 见第一章。9、质粒酶及电泳试剂: 见第二章。 第三节 操作步骤 一、 连接反应 1、取新的经灭菌处理的 0.5ml eppendorf 管, 编号。 2、将 0.1g 载体 DNA 转移到无菌离心管中，加等摩尔量( 可稍多)的外源 DNA 片段。 3、加蒸馏水至体积为 8l,于 45保温 5 分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物
11、冷却至 0。4、加入 10T4 DNA ligase buffer 1l, T4 DNA ligase 0.5l, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于 16保温 8-24 小时。 同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源 DNA；对照组二只有外源 DNA 片段没有质粒载体。二、 E. coli DH5 感受态细胞的制备及转化每组连接反应混和物各取 2l 转化 E. coli DH5 感受态细胞。具体方法见第三章。三、 重组质粒的筛选 1、每组连接反应转化原液取 100l 用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。 2、倒置平板于 37继续培养
12、12-16 小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。 3、放于 4数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做） 。 不带有 pBS 质粒 DNA 的细胞,由于无 Amp 抗性,不能在含有 Amp 的筛选培养基上成活。带有 pBS 载体的转化子由于具有 -半乳糖苷酶活性 ,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在 X-gal 和 ITPG 培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了 -半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和 x-gal 和ITPG 培养基上均为白色菌落。 四、 酶切鉴定重组质粒 用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含 Amp 50g/ml 的 5ml LB 液体培养基中,3
13、7下振荡培养 12 小时。使用煮沸法快速分离质粒 DNA 直接电泳，同时以煮沸法抽提的 pBS 质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较 pBS 慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。注意 1、DNA 连接酶用量与 DNA 片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的 10-100 倍。 2、在连接带有粘性末端的 DNA 片段时，DNA 浓度一般为 2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA 浓度至 100-200mg/ml。 3、连接反应后，反应液在 0储存数天，-80储存 2 个月，但是在-20 冰冻保存
14、将会降低转化效率。4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管 T4 DNA 连接酶的最适反应温度为 37，在连接粘性末端时，反应温度以 10-16为好，平齐末端则以 15-20为好。 5、在连接反应中，如不对载体分子进行去 5磷酸基处理，便用过量的外源 DNA 片段（2-5 倍） ，这将有助于减少载体的自身环化，增加外源 DNA 和载体连接的机会。 6、麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体 DNA 的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影
15、响挑选。 7、X-gal 是 5-溴-4-氯-3- 吲哚 -b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG 是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导 lacZ 的表达。 8、在含有 X-gal 和 IPTG 的筛选培养基上，携带载体 DNA 的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在 37培养后放于冰箱 3-4 小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。DNA 分子的限制
16、性内切酶消化 限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的 DNA 序列位点上并在此切割双链 DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为 4、5 或 6 个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割 DNA 双链而产生带平端的 DNA 片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的 DNA 片段。1 个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在 50l 体积 1 小时内完全切开 1g 噬菌体 DNA 所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所
17、有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10、5）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对 DNA 消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的 0.5ml 离心管中进行。2.20l 体积反应体系如下： DNA 0.2-1 g10酶切 buffer 2.0 l限制性内切酶 1-2 u（单位）加 ddH2O 至 20 l限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为 37水浴消化 1hr。3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达 50-200l，各反
18、应组分需相应增加。4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。5.酶切结束时，加入 0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达 10mM，以终止反应。或将反应管在 65水浴放置 10min 以灭活限制性内切酶活性。6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入 0.6 体积的 5M乙酸铵（或 1/10 体积 3M NaAc）和 2 倍体积无水乙醇，在冰上放置 5min，然后于 4离心12000g 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干 DNA 沉淀后溶于适量 TE 中（pH 7.6）。7.如要纯化消化
19、后的 DNA，可用等体积酚/氯仿（11）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、电泳检测取质粒酶切产物适量，加适当 loading buffer 混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm 的电压，使 DNA 分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。 三、注意事项1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以 1限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。2. 购买的限制性内切酶多保存于 50%甘油中，于-20是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污
20、染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的 10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量 DNA 时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。5.注意星号酶切活力。目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的 DNA 片段进行重新克隆，其目的在于对目的 DNA 进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的 DNA 片段和载体的制备；(2)目的 DNA 片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备1LB 液体培养基：胰
21、化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加 ddH2O 至 1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in 2高压灭菌 20min。21.5%琼脂 LB 固体培养基: 称取 1.5g 琼脂粉放入 300ml 锥形瓶,加 100ml LB，15 lbf/in 2 高压灭菌 20min，稍冷却，制备平皿。3IPTG、X-Gal40.1M MgCl 2 ：15 lbf/in 2高压灭菌 20min，0冰浴备用。50.1M CaCl 2（以 20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in 2高压灭菌 20min，0冰浴备用。6限制性核酸内切酶、T4 DNA 连接
22、酶。二、目的 DNA 片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的 DNA 和载体，获得线性 DNA，用于重组。根据目的 DNA 和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述） 三、利用 T4 DNA 连接酶进行目的 DNA
23、片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果 外源 DNA 片段末端性质 连接要求 连接结果 不对称粘性末端 两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率 载体与外源 DNA 连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源 DNA 可以定向插入到载体中。 对称性粘性末端 线形载体 DNA常需磷酸酶脱磷处理 载体与外源 DNA 连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源 DNA 的串联拷贝；外源 DNA 会以两个方向插入到载体中。 平端 要求高浓度的DNA 和连接酶 载体与外源 DNA 连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源 DNA 的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。 带有相同
24、末端(平端或粘端)的外源 DNA 片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源 DNA 和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个 DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除 5磷酸基团以抑制载体 DNA 的自身环化。利用 T4 DNA 连接酶进行目的DNA 片段和载体的体外连接反应，也就是在双链 DNA 5磷酸和相邻的 3羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有 5磷酸（未脱磷），可形成 4 个新的磷酸二酯键；如载体 DNA已脱磷，则只能形成 2 个新的磷酸二酯键，此时产生的重组 DNA
25、 带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4 DNA 连接酶对目的 DNA 片段和载体连接的一般方案1连接反应一般在灭菌的 0.5ml 离心管中进行。210l 体积反应体系中：取载体 50-100ng，加入一定比例的外源 DNA 分子（一般线性载体DNA 分子与外源 DNA 分子摩尔数为 11-15），补足 ddH2O 至 8l。3轻轻混匀，稍加离心，56水浴 5min 后，迅速转入冰浴。4加入含 ATP 的 10Buffer 1l，T4 DNA 连接酶合适单位， 用 ddH2O 补至 10l，稍加离心，在适当温度（一般 14-16水浴）连接 8-14hr。四、连接产物的转化1.
26、感受态细胞的制备 保存于-70的 DH5（或其他菌种）用接种环划菌于 1.5%琼脂平板上，37恒温倒置培养至单菌落出现（约 14-16 hr）。 挑取单菌落，接种于 2.0ml LB 液体培养基中，37恒温，250g 振荡培养过夜（约 12hr）。 取 0.5ml 过夜培养液，接种于 100ml LB 液体培养基中，37振荡培养 2-2.5hr，至 OD600为 0.4-0.5 时，放置于 4冰箱冷却 1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。） 将培养液分入两个 50ml 离心管中，4离心，4000g10min，弃去上清，用冰浴的 0.1M MgCl2 25ml 悬浮 30min。 4离心
27、,4000g10min，弃去上清，加入冰浴的 0.1M CaCl2-甘油溶液 1ml 悬浮。 以 100l/管分装入 1.5ml 离心管中，-70冻存备用。注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生 5106-2107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。2. 连接产物的转化 取 100l 贮存于-70钙化菌，冰浴化开；+ 加入适量连接产物（一般不超过 10l，轻轻混匀，冰浴 20min； 于 42热休克 90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴
28、 2-3min； 加入 LB 液体培养基 500l，于 37缓摇孵育 45min； 将培养物适量涂于 1.5%琼脂 LB 平板( 根据质粒性质添加抗生素 AMP 即氨苄 50g/ml），待胶表面没有液体流动时，37温箱倒置培养 12-16hr。五、重组子的筛选根据载体的遗传特征筛选重组子，如 -互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段，其中有 -半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到 -半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码
29、-半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为 -互补。由 -互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无 -互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板 37温箱倒置培养 12-16h
30、r 后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。六、注意事项1. 目的 DNA 片段制备、回收、纯化时，应避免外来 DNA 污染。2. 不同厂家生产的 T4 DNA 连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质 DNA 分子连接的 T4 DNA 连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10、5、2），其中多已含有要求浓度的 ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。2. 连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源 DNA 的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组 DNA 也得到增
31、殖。3. 制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in 2高压灭菌20min。5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。原核表达 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在
32、基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下： 获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。2、100mM IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG 溶于 100ml ddH2O 中,0.22m 滤膜抽滤，-20保存。二、操作步骤（一）获得目的基
33、因1、通过 PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。2、通过 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法从细胞或组织中提取总 RNA，以 mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。2、PCR 产物双酶切后回收，在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。（三） 获得含重组表达质粒的表达菌种1、 将
34、连接产物转化大肠杆菌 DH5，根据重组载体的标志（抗 Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、 以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至 2ml LB（含 Amp50g/ml）中 37过夜培养。2、按 150 比例稀释过夜菌，一般将 1ml 菌加入到含 50mlLB 培养基的 300ml 培养瓶中, 37震荡培养至 OD6000.4-1.0（最好 0.6，大约需 3hr）。3、取部分液
35、体作为未诱导的对照组,余下的加入 IPTG 诱导剂至终浓度 0.4mM 作为实验组,两组继续 37震荡培养 3hr。4、分别取菌体 1ml, 离心 12000g30s 收获沉淀，用 100l 1%SDS 重悬，混匀, 7010min。5、离心 12000g1min，取上清作为样品,可做 SDS-PAGE 等分析。三 、注意事项1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2、融合表达时在选择外源 DNA 同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。表达蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理
36、细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂 SDS 与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的 SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37 OC 溶解,定容至 100ml, 棕色瓶存于室温。2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g 加 ddH2O 溶
37、解, 浓盐酸调 pH 至 8.0,定容至 100ml。3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g 加 ddH2O 溶解, 浓盐酸调 pH 至 6.8,定容至 100ml。4、10% SDS：电泳级 SDS 10.0 g 加 ddH2O 68助溶,浓盐酸调至 pH 7.2,定容至 100ml。5、10 电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml 加 ddH2O 溶解, 定容至 100ml。6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP 加 ddH2O 至 10ml。7、2 SDS 电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (
38、pH 6.8)2.5ml，-巯基乙醇 1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH 2O 3.5ml。8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇 225ml，冰醋酸 46ml，ddH 2O 225ml。9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH 2O 以 316 配制而成。二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、 分离胶(10%)的配制: ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl 2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取 1ml 上述混合液,加 TEMED(N,N,N,N-四甲基
39、乙二胺)10l 封底,余加 TEMED 4l ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合需 30-60min）2、 积层胶（4%）的配制：ddH2O 1.4 ml30%储备胶 0.33 ml1M Tris-HCl 0.25 ml10%SDS 0.02 ml10%AP 0.02 mlTEMED 2 l将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需 15-30min。（二）样品处理：将样品加入等量的 2SDS 上样缓冲液，100加热 3-5min，离心12000g1min，取上清作 SDS-PAGE 分析，同时将 SDS 低分子量蛋白标准品作平行处理。（三
40、）上样: 取 10l 诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入 20l 低分子量蛋白标准品作对照。（三） 电泳:在电泳槽中加入 1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压 60V,分离胶电压 100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需 3hr）。（四） 染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温 4-6hr。（五） 脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。（六） 凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或 7%乙酸溶液中。三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。2、为达到较
41、好的凝胶聚合效果，缓冲液的 pH 值要准确，10%AP 在一周内使用。室温较低时，TEMED 的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。表达蛋白的分离与纯化 大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起 DNA 克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管 DNA 序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质
42、则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是 Studier 等发展的以噬菌体 T7RNA 聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的 2%以上，有些甚至高达 50%。一、可溶性产物的纯化（融合 T7Tag 的表达蛋白）（一
43、）试剂准备采用 T7 Tag Affinity Purification Kit1T7Tag 抗体琼脂。2B/W 缓冲液：4.29mM Na 2HPO4，1.47 mM KH 2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。4. 洗脱缓冲液: 0.1M 柠檬酸，pH2.2。5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。1. PEG 20000。（二）操作步骤1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心 5000g5min，弃上清，收获菌体，用 10ml 预冷的 B/W 缓冲液重悬。2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4离心 14000
44、g30min，取上清液，0.45m膜抽滤后作为样品液。3. 将结合 T7Tag 抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。4. B/W 缓冲液平衡后样品液过柱。5. 10ml B/W 缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。6. 用 5ml 洗脱缓冲液过柱，每次 1ml，洗脱液用含 150l 中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接 SDS-PAGE 分析。7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析 24hr，中间换液数次。8. 用 PEG 20000 浓缩蛋白。（三）注意事项蛋白在过层析柱前，要 0.45m 膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。二、包涵体的纯化包涵体是外源基因在原核细胞
45、中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋
46、白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的 40%95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA 聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。（一）试剂配制1缓冲液 A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。2缓冲液 B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。3缓冲液：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。4
47、缓冲液：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。1缓冲液：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。5缓冲液 C：8M 脲素，10mM-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA 及脱氧胆酸钠。（二）操作步骤1用缓冲液 A 漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心 6000g15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液 A 中洗涤一次。2将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液 B 中，超声破碎，镜检
48、，破碎率高于 95%，离心1500g30min，收集包涵体沉淀。3将包涵体沉淀用缓冲液、缓冲液、缓冲液分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。4包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置 30min，然后离心 1500g30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。5溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。表达蛋白的生物学活性的检测 一、MTT 比色法检测细胞活性（一）原理活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的 MTT 形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过 MTT 比色法进行。（二）试剂准备1、 青链霉素溶液（100X）：青霉素 100 万 U，链霉素 100 万 U，溶于 100mlddH2O 中, 抽滤除菌。2、 L15 基础培养基：1000mlL15 培养基，加 2g 碳酸氢钠，10ml 100X 青链霉素，5mlHEPES。3、 MTT 液：5mg/ml 溶于 L15 基础培养基。4、 SDS 处理液：20gSDS，50l 二甲基甲酰胺，加双蒸水 50ml 溶解。5、 L-多聚赖氨酸：50g 溶于 1ml 双蒸水中。6、
