1、Diagnostic Microbiology:微生物学的一个分支 ,主要研究各种微生物的实验室方法,即如何快速、正确地检出微生物，以帮助诊断或判断。*微生物分类的基础:（三种基本类型）1、非细胞型微生物：这类微生物体积小，能通过细菌滤器、无细胞结构、无产生能源的酶系统，由单一核酸（DNA 或 RNA)核蛋白衣壳组成。必须在活的易感细胞内生长繁殖。属于这类的微生物是病毒。2、原核细胞型微生物:他们由单细胞组成，细胞核的分化程度较低，仅有原始核，染色体仅有单个裸露的 DNA 分子，无核膜和核仁。细胞壁由肽聚糖构成，缺乏完整的细胞器。属于这类的微生物有细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次体。3、真
2、核细胞型微生物：他们大多由多细胞组成，细胞核分化程度高，有典型的核结构（核膜、核仁核染色体）细胞壁由纤维素、几丁质构成，属于这类型的微生物有真菌、藻类。*微生物检验与鉴定异同相似之处：菌株的分离、纯化 、性状测定等区别1. 工作目的鉴定（分类）：对分离物进行识别，并按相似性或同源性界定该分离物在分类系统中的地位。鉴定（检验）：分离物在检验对象中是否存在是问题的关键，而该菌的分类地位并不重要。2. 诊断(鉴定)方案是在分类研究的基础上制定出来的。3. 检验过程中,多采用特有的鉴别特征或试验,而无须象分类鉴定工作那样,需对分离物进行全面的分析。检验中，多选用形态和生理生化等表型特征。必要时才借助一
3、些较复杂的方法：DNA 碱基组成、核酸同源性等。*快速鉴定：在对样品进行检测的过程中，无须进行微生物的分离纯化或常规试验，而利用有关技术，在几小时乃至几十分钟内从混杂样品中直接确定是否存在某种活菌、微生物产物或抗原成分的鉴定方法。革兰氏染色染色原理化学学说：G+ 菌与核蛋白镁盐、多糖形成复合物（ G+核蛋 白镁盐多糖） ，可与结晶紫I2 牢固结合。等电点学说： G+（pI = 2 3） G- （pI = 4 5）中性溶液中，电荷数 G+ G- 菌，易与碱性染料结合，不易脱色。渗透性学说：与菌体细胞壁结构有关。G+的细胞壁是肽聚糖形成的网状结构；G细胞壁成分是肽聚糖含量的，主要是脂壁酸，结构松散
4、。分离1） 稀释分离 （经典、标准分离法） 适用于饮水、牛乳、植物病原菌、尿液等样本稀释度 10-1 10-52） 划线分离（曲线划线法） （常用技术）分区划线法：多用于含菌量较多的样品。连续划线法：含菌量不多的样本或培养物一般接种方法(5 种）1）斜面接种法(沾菌和挑菌) 用于移植纯种，鉴定或保存菌种之用2）穿刺接种 多用于双糖、半固体、明胶等培养基的接种双糖铁：直刺至管底； 细菌动力观察： 不穿至管底3） 液体接种:挑菌或稀释接种 单糖发酵试验4）倾注平板接种法:融化 45-50时混菌接种抑制真菌试验5）涂布接种法:加一定量的菌液用涂棒涂均匀抑制细菌和酵母菌试验固体培养基 菌落描述方法：光
5、滑型（S 型）：边缘整齐，表面光滑粗糙型（R 型）：表面粗糙，边缘不整齐，有些是 S 型的失去菌体表面多糖或蛋白质形成的。黏液型（M 型）： 表面光滑，湿润有粘液，多见于有厚莢膜或丰富的黏液层的细菌。细菌的生化试验：由于不同的细菌产生的酶系不同，因而对底物的分解能力也不同，用生物化学的方法测定这些代谢产物，可用来区分和鉴定细菌，这种生化反应的测试方法即称为生化试验葡萄糖的氧化/发酵试验，又称 O/F 试验或 Hugh leifson(HL)试验：原理：细菌分解葡萄糖可分为氧化型、发酵型和产碱型三种类型。氧化型：仅在有氧的环境中分解葡萄糖发酵型:无论在有氧或无氧的环境种都能分解葡萄糖产碱型：无论
6、在有氧或无氧的环境中都不能分解葡萄糖适合与 G肠道杆菌的鉴别： G肠道杆菌为发酵型；其它为非发酵型；微球菌均为氧化型；葡萄球菌为微产碱型。其它生化试验溶血试验原理： 细菌代谢过程中产生溶血素，使红细胞溶解方法： 平板法 ： 接种菌到血液琼脂平板， 35 24 h 溶血：又叫草绿色溶血在血平板上细菌菌落周围的培养基出现 12mm 的草绿色溶血环，溶血环中的红细胞外形完整无损，可能是细菌的代谢产物使红细胞中的血红蛋白变为高铁红蛋白。 溶血：又称完全溶血，由于细菌产生的溶血素使红细胞完全融解，菌落周围形成一个完全清晰的透明的溶血环。 溶血：即不溶血，菌落周围的培养基无变化，红细胞未溶解或损失。 试管
7、法 细菌接种肉汤培养基，16 18 h，加等量生理盐水洗涤三次的 2%羊红细胞悬液，35，30 min 观察，液体澄清透明，为溶血。血清学反应（serologic reactions)：抗原（antigen） 、抗体（antibody）在适宜条件下，在体外发生的特异反应。Ab 存于血清中，故称。包括：血清凝集试验、诊断血清血清凝集试验：在适当电解质存在下，细菌等颗粒性抗原与相应抗体发生特异性结合，进一步形成肉眼可见的凝集小块。诊断血清：用已知的标准菌株免疫动物（家兔）而获得的血清。诊断血清的种类 多价诊断血清（混合诊断血清）：-含两种或两种以上抗原的免疫血清。 单价诊断血清： 仅含 1 种（型
8、）细菌相对应的血清。 因子诊断血清：某种细菌所特有的特异性抗体。 血清试验主要类型凝聚试验（直接凝集反应和间接凝集反应）（1）玻片凝集：结果： 诊断血清 生理盐水 判断凝集 混浊 +凝集 凝集 自凝现象混浊 混浊 _（2）试管法（为半定量的试验方法）系用等量的抗原（细菌）悬液与一系列递倍稀释的抗血清混合，37保温 4h 后放室温或 4冰箱过夜，次日观察结果。根据每管内细菌的凝聚程度判定血清中抗体的相对含量。以血清最高稀释度应有明显凝聚现象者，为该菌的凝聚校价。*1)直接凝聚反应：颗粒性抗原与相应的抗体直接结合的凝聚现象。*2)间接凝聚反应：将可溶性抗原包被颗粒性载体（红细胞或乳胶颗粒) 表面与
9、相应抗体发应的凝聚现象。如检测类风湿因子。SPA 协同凝聚试验（间接）试验中所用的载体是一种金色葡萄球菌，该菌的细胞壁中含有葡萄球菌 A 蛋白（Staphylococcus proteinA.SPA),SPA 能与人的及哺乳动物血清中的 IgG 的 FC 段结合，并使其暴露于葡萄球菌的表面，当结合于葡萄球菌的表面已知抗体于相应的细菌抗原接触时，则出现肉眼可见的凝聚现象。简便、快速、灵敏度高、易于观察。中和试验:抗体使相应的毒素或病毒丧失生物活性的现象称为中和反应。在易感动物或组织培养中进行。酶联免疫吸附试验（ELISA）是利用抗原或抗体能非特异的吸附于聚苯乙烯等固体载体表面的特性，使抗原抗体反
10、应在固体载体表面进行的一种免疫技术。防止菌种变异的措施1、控制传代的次数2、用典型的菌落传代：为防止盲目的传代用分区画线方法分离，选取原典型的菌落传代。3、通过易感动物（植物）选择，又叫菌种复壮;不但致病性可以恢复，表形变异的菌种也可恢复原有特性。扩散法（K-B 法）：纸片琼脂扩散法，是一种半定量的方法。原理：药物借助其分子的扩散能力向周围的琼脂中扩散，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映代测菌对所需浓度时，则该区的细菌不能生长。该药抑菌圈直径对待测菌的 MIC 呈负相关，既抑菌圈越大，MIC 越小。基因芯片：是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子，如核酸片断、多肽分子、细胞、甚至
11、组织切片等生物样品有序的固定于支撑物（如玻片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子进行杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测，从而判断样品中靶分子的数量及质量，由于该技术在制作过程中模拟计算机芯片的制备方法 ，所以称为生物芯片技术。基因芯片的分类：测序芯片：只要用于测序研究表达芯片：是通过测定特定基因的 mRNA 的量来推断基因的表达活性的，所以芯片的碱基序列是特异的。比较芯片（诊断芯片）：主要应用于基因组的比较，来判断样品中特定基因序列的相对含量。肺炎链球菌的检验
12、检验方法：1、直接镜检：2、分离培养：可以用纯培养菌种作以下试验：（1）Optochin 敏感试验：是未知菌涂平板，沾取 optochin 的纸片摆放中央出现抑菌环，对肺炎链球菌的抑菌环大于 18mm；而对其它的链球菌的抑菌环小于 15mm。Optochin奥普托锌（乙基氢化卜林）（2）胆盐溶菌试验：胆盐能通过活化肺炎链球菌的自溶酶而将肺炎链球菌溶解。但不能溶解草绿的链球菌。（3）菊糖发酵试验：上述三个试验区别于甲型链球菌。3、动物试验：小鼠对肺炎链球菌敏感。常用来进行病原的分离和毒力试验，有毒的菌株，在接种后 1236h 败血症死亡。4、莢膜肿胀试验：可以鉴定菌型。军团菌的检验衣原体：一 种
13、 既 不 同 于 细 菌 也 不 同 于 病 毒 的 一 种 微 生 物 ， 属 于 原 核 生 物 ， 即 细 胞 内 没有 形 成 核 膜 的 细 胞 核 。立克次体：是 介 于 最 小 细 菌 和 病 毒 之 间 的 一 类 独 特 的 微 生 物 ， 它 们 的 特 点 之 一 是 多 形性 ， 可 以 是 球 杆 状 或 杆 状 ， 还 有 时 出 现 长 丝 状 体 。支原体：为 目 前 发 现 的 最 小 的 最 简 单 的 细 胞 ， 也 是 唯 一 一 种 没 有 细 胞 壁 的 原 核 细 胞 。支 原 体 细 胞 中 唯 一 可 见 的 细 胞 器 是 核 糖 体 。螺旋
14、体：细 长 、 柔 软 、 弯 曲 呈 螺 旋 状 的 运 动 活 泼 的 单 细 胞 原 核 生 物 。真菌检验中 KOH 溶液的作用：KOH 可促进角质蛋白的溶解，易检查到菌体。培养方法 需氧培养：（1）直接培养：表面消毒的组织等。（2）试管培养：常用，保存菌种等。（3）大培养（培养皿、斜面及特殊培养瓶等）培养皿： 点植接种（一点或三点） 斜面： 划线（产孢子）点种斜面底部（镰刀菌）菌丝块（不易产孢者）（4）小培养（载玻片法平皿上也可进行）：用于观察真菌的生长状况。（5）郭可大钢圈小培养法：在灭菌钢圈置于载片上，钢圈内注入培养基，接种菌种，在湿室内培养，逐日检查，也可滴入乳酸棉蓝染色检查。
15、*病毒的诊断主要有三个方面：（1）检测病毒体及其所致宿主细胞的病理改变（2）检测病毒蛋白抗原成分和核酸（3）检测病毒抗原刺激机体产生的免疫蛋白乙肝病毒的检验： 1、目前主要用血清学的方法检测 HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe 及抗HBc（IgM 及 IgG） 。 HBsAg 检测最为重要，可发现无症状携带者。常用的方法是放射免疫法和 ELISA 法。 2、血清 HBV 的 DNA 的检测：应用核酸杂交及 PCR 检测血清中的 DNA。 3、血清 DNA 多聚酶的检测：可作为病毒复制的指标。 4、结果分析见表卫生微生物学： 应用微生物的理论和检验方法，根据卫生学观点，来研究与人类有关的
16、外界环境（水、土壤、空气等）中微生物的种类、性质、活动规律及其对人类生活、健康影响的科学。水的细菌卫生学指标常用检测指标：细菌总数、大肠菌群数、粪大肠菌群数、粪链球菌细菌总数（杂菌数、需氧菌数 ）指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养 48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。意义： 一定程度上，反映了被检物（水）中存活的细菌数 缺点： 不能反映真菌、放线菌、病毒、螺旋体等的污染情况 不能测出样品中的实际总活菌数（厌氧菌、嗜冷菌等） 流行期间，还应参照其他污染指标 检验方法：
17、国家规定通常采用的测定方法：琼脂倾皿法（倾注培养）大肠菌群（coliform group） 一群在 35 37 、24h 发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的 G-性无芽孢杆菌意义：作为受粪便污染的指标大肠菌群越多，受粪便污染的程度越大，即受肠道中病原菌随粪便侵入的可能性越大。 缺点： 不能检出肠道病毒 不能准确反映水体中的大肠菌群 对低温菌占优势的水产品及其他冷血动物不一定适用 （肠球菌作为此类食品指示菌的趋向） 表示方法：大肠菌群近似值（MPN， Maxium Probable Number）水： 每升水样中所含的大肠菌群数其余样品：100g 或 100ml 样品中大肠杆菌近似值 检测方法
18、： 发酵法、滤膜法、纸片法等粪大肠菌群一群在 44.5 、24h 发酵乳糖，产酸产气并结合靛基质反应阳性的一类阴性杆菌。意义：体现水体被粪便污染的时期，结合大肠菌群。近期污染：两种指标均高或粪大肠菌群高、大肠菌群低。远期污染：大肠菌群高，粪大肠菌群低或没有。 检测方法：发酵法粪链球菌：根据最新分类原则，粪链球菌又叫粪肠球菌。温血动物肠道内的正常菌群，粪链球菌进入食物链的主要原因是不卫生的加工条件所致的，一般与直接的粪便感染无关，单独检测，不能作为粪便污染决定性指征。一般用粪大肠菌群与粪链球菌之比（FC / TC）作为判断粪污染的来源FC / TS 4.1 ； 污染来源于人的粪便FC / TS
19、2，报告其中较小的数字注： N1、N2 为计算后的细菌总数均 300 ，按稀释倍数最高者 稀释倍数均 300 或 30 时，以最接近 300 或 30 者为准，其平均菌落数 稀释倍数。若所有均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数报告3）菌落数报告格式100 以内，以实有数报告大于 100 时，取 2 位有效数字，其后的数字以“四舍五入”计算，为缩短数字后的“0”数，可用 10 的指数表示。4、注意事项1）所用器皿均完全灭菌，避免二次污染。2）稀释的液体，应有空白对照。3）应以 dw 或生理盐水、 PBS, 用 0.1% 的蛋白胨水为适。4）稀释水样时，吸管应插入液体内部，不得低于液面 2.5 c
20、m。吸入时，应先高于吸管高度，提取离开液面，紧贴管内壁放到所需位置。大肠菌群的检测：检验程序：发酵法1） 生活饮用水（12 管法）初发酵 3 x 乳糖胆盐 50ml （2 支） ； 各加水样 100ml3 x 乳糖胆盐 5ml （10 支） ；各加水样 10 ml接种检样水的体积 ： 300ml 36 1 ， 24h 2 h分离培养（平板分离） 品红亚硫酸钠或伊红美蓝培养基36 1 ，18 24 h观察菌落形态，取可疑菌落 1 3 个，G 氏染色和证实试验证实试验（复发酵试验）1 3 个可疑菌落经 G 染色（-）性者同时做乳糖胆盐发酵。 报告证实为阳性（+）的管数，查 MPN （大肠菌群近似值
21、）检索表报告： 1L 水样中的大肠菌群数。注意事项：程序：三步，初发酵的结果不可靠，不是纯菌发酵。一般平板上典型菌落较多，G 染色（- ）杆菌，确定平板典型菌落少，多挑菌落挑取菌落一定为典型，无典型则多选几个伊红美兰培养基（EMB）多紫黑色，带或无金属光泽产气量未产气的发酵管，用手轻敲或摇动试管，有气泡沿壁上浮，做产气胆盐 是抑制剂，可抑制非大肠杆菌的生长。证实试验 大肠杆菌在 EMB 上典型的菌落是紫黑色，有金属光泽或无金属光泽。而红色或粉红色的检出率很低。证实试验要选择典型菌落或多挑几个。以免出现假阳性。食物中毒：经口进食正常数量“可食状态”的含有致病菌、生物性或化学性毒物以及动植物天然毒
22、素食物而引起的、以急性感染或中毒为主要临床特征的疾病，统称为食物中毒。细菌性食物中毒：细菌性食物中毒以胃肠道症状为主，常伴有发热，其潜伏期相对于化学性的较长。1、特点： 有明显的季节性，多气候炎热和湿度较高的季节，5 10 月份最多常常为集体突然暴发，发病率高，中毒死亡率较低一般在几小时至 48h 内发病，病程短，预后良好 2、常见引起中毒的细菌感染型细菌： 沙门氏菌（Salmonella） 、链球菌、变形杆菌等毒素型细菌产肠毒素菌： 副溶血弧菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、志贺氏菌、铜 绿假单胞、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等产外毒素菌：肉毒梭菌等混合型细菌致病性大肠杆菌霉菌毒素及其引起的食物中毒
23、大约有 1/10 的霉菌可产生有害的霉菌毒素。有些可发生急性的食物中毒，有些霉素少量长期的摄入可产生慢性、潜在性的危害，由赤霉与污染禾谷镰刀菌的玉米造成食物中毒是较常见的霉菌毒素引起的食物中毒。主要毒素是赤霉稀酮，食后半小时就可出现恶心、呕吐、浑身乏力。赤霉病变用作饲料尚可引起家畜流产。常见霉变食品的食物中毒有霉变甘蔗中毒、霉变甘薯中毒等，多见于我国北方。 * 真菌性食物中毒：食物受到某些霉菌的污染后，霉菌在其中生长繁殖产生真菌毒素所引起的中毒食品卫生标准中的微生物指标主要检测指标食品的微生物污染有细菌、霉菌、酵母等细菌指标：细菌总数、大肠菌群数、肠球菌、致病菌主要检测指标：细菌总数、大肠菌群
24、和致病菌种类样品种类样品种类可分为大样、中样、小样三种。大样: 系指一整批即从一大批食品中采取的能代表该批粮油和食品的样。一般每件2Kg,又称原始样品。中样: 从大样品各部分取得的混合样品即从大样中均匀地分出一部分供检验全部有关项目的样品，一般以 200g 为准。又称平均样品小样: 系指做分析用的样品即从中样中分出的直接用于检验的样品，称为检样。一般以 25g 为准。 真菌毒素（mycotoxin）：真菌产生的次级代谢产物，目前已知有 200 多种不同的真菌毒素。我国关于黄曲霉毒素在食品中指标：B1：是已知毒性最强的天然物质，已知各种真菌毒素中最稳定的一种。 (1)玉米、花生（仁）油 20 ug / Kg (2)大米、其他食品油 10 ug/ Kg(3)婴儿代乳食品 不得检出M1 ： 牛乳 0.5 ug / Kg乳制品按含乳量计算AFB1( Aflatoxins B1) ：二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素） 。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。黄曲霉毒素 M1（AFM1） 是 AFB1 经动物代谢产生的衍生物，AFM1 的毒性（雏鸭经口LD500.32mg/kg）仅次于 AFB1，致癌性也相似。
