1、第一章 PCR1 PCR 的英文全称是什么? Polymerase Chain Reaction2 PCR 是谁发明的？Kary Mullis3 PCR 的基本原理是什么？PCR 的基本工作原理是以拟扩增的 DNA 片段为模板，以一对分别与模板 DNA 互补的寡核苷酸为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板 DNA 链延伸，直至新的 DNA 合成。不断重复这一过程，则可使目的 DNA 片段得到扩增。4 PCR 反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？PCR 反应中一般会产生 2 种不同长度的产物：一种是预期长度的产物，一种是比预期长度
2、长得多的产物；前者以指数级数增加（2 n） ，后者以几何级数增加（2n） 。因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。5 一般 PCR 反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？7 种基本成分:模板,特异性引物 ,热稳定 DNA 聚合酶,脱氧核苷三磷酸 (dNTP),二价阳离子,缓冲液及一价阳离子,石蜡油(可忽略)模板：待扩增的 DNA 或 RNA,甚至细胞；引物：与靶 DNA 的 3端和 5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定 PCR 特异性的关键。只有每条引物都与靶 DNA 特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的 5端决定了扩
3、增产物的 5端位置。说明引物决定了扩增片断的长度、位置和结果。DNA 聚合酶：a. 聚合作用，将 dNTP 中脱氧单核苷酸逐个加到 3-OH 末端,b.3-5外切酶活性，校正功能,c.5-3 外切酶活性，切除错配核苷酸；石蜡油：维持恒热和整个体系中盐浓度，减少 PCR 过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。6 PCR 反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？基因组 DNA、噬菌体 DNA、质粒 DNA、cDNA、mRNA、预先扩增的 DNA 均可作为模板。PCR 反应对模板纯度要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的样品即可以作为模板；但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq
4、酶抑制剂和任何可以结合 DNA 的蛋白；虽然片段长短不是影响 PCR 效率的关键因素，短片段模板 PCR 效率更高；为保证反应的特异性，应使用 ng 级的克隆 DNA、g 级的单拷贝染色体DNA、或 104 拷贝的待扩增片段。7 什么叫 PCR 的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？引物：所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶 DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的 5端决定扩增产物的 5末端位置。(引物要大大过量)特异性引物：引物是与靶 DNA 的 3端和 5端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定 PCR 特异性的关键。只有当每条引物都能特异性地与模板 DNA
5、 中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。简并性引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。8 引物设计的基本原则有哪些？a. 引物长度一般在 2024bp(16,30) ：这样长度的引物保证了不易形成杂合体；b. （G+C）%含量：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列时应与模板的相近。40%-60%c. 引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构；d. 两引物间不可发生互补(特别是 3端，若不可避免那 3端互补碱基不可超过 2 个碱基) ；e. 引物 3端配对：引物 3端为
6、DNA 聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此该端 5-6 个碱基与 DNA 的配对必须严格、准确。9 PCR 中使用的 DNA 聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？a. Klenow 片段：为 DNA 聚合酶 的片段，有聚合酶活性和 35外切酶活性(最适 37)；b. Taq 酶：耐热 DNA 聚合酶，可耐受 9395 摄氏度(最适 74-75)，是 PCR 普及的关键。它避免了不断补加 DNA 聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和 DNA 二级结构对PCR 的干扰，提高了 PCR 的特异性、敏感度和产量。它没有 35外切酶活性，无校对功能，点突变较多。依赖 Mg2+。c. S
7、toffel 片段：第二代耐热 DNA 聚合酶，去除 Taq 酶的 53外切酶活性，将 97.5 摄氏度的半衰期提高到 20min，而 Taq 酶只有 5min；对复合 PCR（2 个或以上模板位点的 PCR）更有效；d. VentTMDNA 多聚酶：耐受 100 摄氏度以上高温达 2h；具有校对功能(35外切酶活性) 。e. RTth 逆转录酶：有依赖于 RNA 的耐热 DNA 聚合酶活性和依赖于 DNA 的耐热 DNA 聚合酶活性，这两种活性分别依赖于 Mn2+和 Mg2+。10 PCR 反应中对于加入的 dNTP 有什么要求？1）dNTP 应具有一定浓度：50-200mol /L, 不得
8、低于 10-15。浓度过高会抑制 Taq 酶活性，较低浓度可降低错误掺入；高浓度 dNTPs 易产生错误掺入，而浓度过低会导致产量过低；2）标准 PCR 中包含四种等摩尔浓度的脱氧核苷 三磷酸，否则会诱导聚合酶错误掺入而降低产率、提前终止反应；3)不能反复冻融，否则会降解。11 PCR 反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，因为耐热 DNA 聚合酶需要游离的二价阳离子作为辅助离子，它影响着 PCR 的产量和特异性。常用 Mn2+和 Mg2+, Ca2+无效。(引物与 dNTP 都有二价阳离子结合)12 PCR 反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特
9、点？A 变性：双链 DNA 变成单链 DNA。变性温度的高低由 G+C 含量决定；变性时间由 DNA 链长度决定。常规 PCR 变性条件为 9495 度 45s。B 退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板 DNA 退火结合；退火是使引物和模板 DNA 复性。复性过程采取的温度（Ta）至关重要。复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低；复性温度太低，引物将产生非特异性复性，导致非特异性的 DNA 片段的扩增。退火温度通常在比理论计算的引物和模板的熔解温度低 35的条件下进行。C 延伸：寡核苷酸引物的延长， 一般在耐热 DNA 聚合酶的最适温度下进行。对于 Taq 酶，为 7278
10、度。D 循环数：PCR 扩增所需的循环数取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一般扩展条件：9460s3760s72120s，共 25-30 个循环13 什么叫 PCR 的反应平台？形成的原因可能是什么？PCR 反应不是无穷的进行，到了 PCR 后期，当产物达 0.31pmol/L 时，由于产物的堆积，使原来以指数增长的速率变成平坦的曲线。形成原因：由于引物和 dNTP 的减少，Taq 酶失活；或由于底物过剩、非特异性产物的竞争、变性时解链不完全、退火时产物单链自己缔合、最终产物的阻化作用。14 提高 PCR 反应的特异性一般可以使用哪几种方法？A 引物设计：引物长度、碱基
11、配对是否严格、GC%含量、退火温度、引物浓度与纯度、稳定性、是否为简并性引物等；B 使用热启动：在变性完成之后再加入 DNA 聚合酶 (或聚合酶才有活性)，这样可以提高特异性，因为DNA 聚合酶在低温时也有活性，可能引起非特异的扩增。C 镁离子浓度：不同的模板和引物有不同的镁离子浓度，应进行预实验进行探索；较高的镁离子浓度会提高产量，同时降低特异性；dNTP 浓度较高时应适当提高镁离子浓度。E 促进 PCR 的添加剂：降低 DNA 熔解温度，从而有助于引物退火并辅助 DNA 聚合酶延伸通过二级结构区，可提高特异性和产率；F 使用巢式 PCR：降低扩增多个靶位点的可能性，提高特异性15 常用的促
12、进 PCR 特异性的试剂有哪些？甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱，PCRx Enhancer Solution。16 什么是热启动？在模板 DNA 完全变性后再加入 DNA 聚合酶（或使 DNA 聚合酶有活性）的方法，可减少低温下 DNA 聚合酶活性造成的非特异性扩增。17 RACE 的全称是什么？Rapid Amplification of cDNA Ends（cDNA 末端的快速扩增）18 什么叫定量 PCR？利用 PCR 反应来测定样品中的 DNA 或 RNA 的原始拷贝数量。利用每个循环都能同步侦测到 PCR 产物的增生，以获得达到反应饱和前的资料。(注：不能根据终产物量来确定起始拷贝数
13、)19 为什么 PCR 中对产物进行终点检定量不准确？(PCR 扩增曲线为 S 型曲线)随着 PCR 的进行，反应体系中的引物、 dNTP，甚至模板都会供不应求，导致 PCR 的效率下降，产物增长速度越来越慢。直到 Taq 酶都被饱和后，反应就进入平台期。在实际实验中，由于各种环境因素的复杂相互影响，每个反应进入平台期的时间及平台期的高低都不同，导致终产物浓度各不相同。即使是重复实验，也不可能做到同时进入平台期。因此反应终产物与原始拷贝数无线性关系，定量不准确。20 什么是定量 PCR 的 Ct 值？Ct 值是如何确定的?Cycle threshold（Ct ）：每个反应管内的荧光信号达到设定
14、的阈值时所经历的循环数，即在 PCR 中，荧光信号开始由本底进入指数增长的拐点处所对应的循环数。Ct 值的含义是：PCR 扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。确定：PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省没置是 315 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。实验操作中，Ct 值定义为极限上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射所对应的 PCR 循环次数。 “基线上方”也就是阈值高度的量化，定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10 倍。阈值所在的横线与 PCR 扩增曲线的交点所指的 PCR 循环次数就是 Ct 值。Ct 值越小
15、，模板 DNA 的起始拷贝数越多；Ct 值越大，反之。正常：1830。Ct 值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于试验质量。21 简述 Taqman 探针技术的原理。Taqman 探针法是高度特异性的定量 PCR 技术，其核心是利用 Taq 酶的 53外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在 TaqMan探针法的定量 PCR 反应体系中，包括一对 PCR 引物和一条探针。探针只与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间。探针的 5端标记有报告基团，3端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发出的荧光能量被淬灭集团
16、吸收，仪器检测不到信号。随着 PCR 的进行，Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其 53外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个 PCR 循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号强度就代表了模板 DNA 的拷贝数。根据其 3， 端标记的荧光猝灭基团的不同分为：普通的 Taqman 探针和 TaqmanMGB 探针22 解释下列各种 PCR 的基本原理：(1) RT-PCR （Reverse Translation-PCR）(获得基因完整编码区序列)RT-PCR 是一种从细胞 mRNA 中高效灵敏地扩增
17、 cDNA 序列的方法。由两大步骤组成，一是反转录(RT)；另一是 PCR。反转录的起始材料为 RNA(mRNA)。RNA 的提取：用异硫氰酸胍-酚-氯仿提取细胞中的 RNA；mRNA 的提取：亲和层析法(mRNA3端的 polyA 尾巴与固定相 oligo(dT)特异性结合)；RT：在反转录酶的作用下，将 mRNA 反转录为 cDNA 第一链，即以 oligo（dT） 、随机六聚寡核苷酸或基因特异序列为引物，与 mRNA 结合之后，在反转录酶的作用下延伸合成 cDNA 第一链，再以其为模板PCR；PCR：设计基因特异的上下游引物，其中上游引物与 cDNA 第一链复性后延伸合成 cDNA 第二
18、链，再以cDNA 第一链和第二链为模板，用上下游引物进行 PCR。(2) 多重 PCR (肿瘤检测)用于检测多个基因的表达，且这些基因都与某一疾病的检测、治疗或预后有关。其原理与常规 RT-PCR 相似，分为反转录和 PCR 两部分，不同点在于：在反转录过程，前者使用 Oligo（dT）或随机六聚寡核苷酸为引物，而不用基因特异性引物；在 PCR 过程，前者需要设计多对引物，以扩增多个基因表达产物。(3) 3-RACE 3RACE 用于 mRNA 已知序列下游(即 3端) 未知序列的扩增，可分为两步。 （1）以与 polyA 尾巴互补的序列为引物， 反转录获得 3末端第一链 cDNA 序列（2）
19、以靠近第一链 cDNA3端的序列为特异引物合成 cDNA 第二链，再 PCR 扩增A反转录获得 3末端第一链 cDNA：3末端本身具有 PolyA，可以与引物结合。引物也同样具有 oligo(dT)，但这种引物在 5端有 OP（Outer Primer）和 IP（Inner Primer）的特殊结构，便于为以后的两轮 PCR 提供引物；在 3端加入一个锚定核苷酸，可以使反转录在紧接着 PolyA 的交界处进行，这样可以有效减少同聚物的产生。B第一链 cDNA3端的扩增：设计两种引物 GSOP 和 GSIP。由于 cDNA 已含有外源性 OP 和 IP 序列，故可以用来自目的基因的 GSOP 和
20、来自锚定序列的外源性 OP 进行第一轮扩增，用 GSIP 和 IP 进行第二轮扩增，以此增强特异性。(4) 简并 PCR 一般 PCR 根据确定的核苷酸序列设计引物，简并 PCR 一般用于已知氨基酸序列而不知道核苷酸序列的情况。根据氨基酸密码子的简并性，设计两组带有一定简并性的引物库，以扩增出未知核苷酸序列的基因。这些引物有很多相同碱基，但也有碱基不同，这样保证了和多种同源序列发生退火。(5) 不对称 PCR不对称 PCR 的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链 DNA。 分为引物浓度不对称 PCR 和 热不对称 PCR。结果是产生大量的单链 DNA，又避免了在检测时要先出去剩余引物的
21、操作。引物浓度不对称 PCR：两引物的浓度不同，其中浓度低的为限制性引物，起决定性作用，只有当限制性引物耗尽后才会开始大量产生 ssDNA；浓度高的为非限制性引物。前 10-15 循环为双链产物，而后为单链。常规热不对称 PCR（常规引物长度不对称 PCR）：一对引物的碱基数目与组成不同造成退火温度不同。 将限制性引物比非限制性引物的退火温度低至少 10 度。在刚开始的 1015 个循环中，退火温度略低于限制性引物的退火温度，产生双链 DNA，以耗尽限制性引物；之后的退火温度便以非限制性引物的退火温度为准，大量产生单链 DNA。交错式热不对称 PCR(TAIL-PCR)：利用一系列序列特异性的
22、巢式引物和一个短的任意引物引导扩增，一种半特异性的 PCR(6) 竞争性 PCR (C-PCR) (mRNA 最精确的定量方法之一，定量 PCR 的改进)首先将 mRNA 逆转录为 cDNA，然后在扩增体系中加入浓度已知的竞争性参考模板，这两种模板都可以与引物竞争性结合，但产物可因大小不同或酶切位点不同而区分开。之后在凝胶电泳上测定两种产物的浓度后即可推断 mRNA 的初始浓度。(7)巢式 PCR 由两轮 PCR 和两套引物组成。首先对靶 DNA 进行第一步扩增，然后从第一次反应产物中取出少量作为模板进行第二次扩增，第二次 PCR 引物与第一步反应产物序列互补，第二次 PCR 扩增产物即为目的
23、产物。提高特异性和灵敏性。外侧引物 25bp，退火温度高(68) ；内侧引物 17bp，退火温度低(46)(8) 降落 PCR(touch-down PCR)降落 PCR 是 Don 于 1991 年最早发明的，退火温度起始于高于 Tm 值计算 15 度，之后每过一个循环温度降低 1(或 n)，直到达到一个较低的退火温度(Tm 值以下 5)，这个温度为“touchdown”退火温度。由于正确和非正确的退火温度造成的产量是指数级的，因此可以使正确产物得到累计。当温度降低到非特异性退火温度时，就会发生非特异性结合，但此时的特异性结合产物已经累计了一个几何级数的优势，因此非特异性结合产物的量不会很多
24、。第 2 章 放射性同位素知识和应用1 什么叫“核衰变”？放射性同位素的原子核很不稳定，会持续不断、自发放地出射线，直到变成另一种稳定同位素。衰变时可放出 射线、 射线、 射线、电子俘获，但不一定几种同时都会放出。2 什么叫半衰期？特点是什么？半衰期：一定数量的放射性同位素原子数目减少到原来一半时所需要的时间。半衰期越长，说明衰变的越慢；反之越快。半衰期是放射性同位素的特征参数，不同的放射性同位素有不同的半衰期。3 分子生物学实验室常用的几种放射性同位素有哪几种？他们的半衰期分别是多少？氢-3 ：12.3 年( E 最小) 碳-14 ：5720 年 磷32：14.3 天( E 最大) 硫35：
25、87.1天 碘131 ：8.05 天 4 什么叫放射源？用放射性物质制成的，能产生辐射照射的物体。5 什么叫同位素示踪法？有什么优点？利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法。灵敏度高(10 14-1018 克水平) 、方法简便、定量定位准确、符合生理条件。6 同位素示踪法中使用的同位素是哪种同位素?在不同的实验中、不同的实验要求下选用的同位素不同。一般情形是根据实验目的和实验周期长短，来选择具有合适的衰变方式，辐射类型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。7 什么叫同位素效应？指放射性同位素（或是稳定性同位素）与相应的普通元素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的
26、明显区别，对于轻元素而言，同位素效应比较严重。8 举例说明同位素示踪法在分子生物学核生物化学中的应用。物质代谢的研究、物质转化的研究、动态平衡的研究、生物样品中微量物质的分析、最近邻序列分析法物质代谢的研究：体内存在着很多种物质，究竟它们之间是如何转变的，如果在研究中应用适当的同位素标记物作示踪剂分析这些物质中同位素含量的变化，就可以知道它们之间相互转变的关系，还能分辩出谁是前身物，谁是产物 ，分析同位素示踪剂存在于物质分子的哪些原子上，可以进一步推断各种物质之间的转变机制。9 放射性测量的原理是什么？探测仪可以分为哪 2 类？放射性同位素发出的射线与物质相互作用，会直接或间接产生电力和激发等
27、效应，以此探测放射性的存在、强度和放射性同位素的性质。分为径迹型和信号型。10 闪烁计数器的工作原理是什么？闪烁型探测器由闪烁体-光电倍增管 -放大器-分析器- 定标器组成。闪烁体吸收射线后发出光信号，被光电倍增管收到而发生光电效应，转化成电信号并逐级放大，最后被定标器记录下来。放射性同位素越多，发出的光信号越多，电信号也越多。11 什么叫闪烁体？一类能吸收能量，并在 1 微秒内甚至更短将能量以光的形式发射出来的物质。12 液体闪烁计数器和晶体闪烁计数器分别适合检测什么样的放射性线？液体闪烁计数器适合检测 -ray 和低能 -ray；晶体闪烁计数器适合 -ray。13 人体各种器官中，对辐射最
28、为敏感的是什么器官?造血器官、胃肠道（小肠最敏感，胃和结肠次之）14 什么叫细胞的间期死亡？增殖死亡？细胞的间期死亡：细胞受辐射照射后，不经分裂，在几小时内死亡。（两类细胞发生间期死亡一类是不分裂或分裂能力有限的细胞，如淋巴细胞和胸腺细胞；另一类是不分裂或可逆性分裂的细胞，如成熟神经细胞、肝细胞、肾细胞等。）增殖死亡：细胞受辐射照射后，经 1 个或几个分裂周期后，因失去增值能力而死亡。主要是由于 DNA 分子损伤后错误修复和染色体畸变等原因造成有丝分裂障碍。15 什么叫外照射？内照射？辐射的确定性效应？随机效应？外照射：辐射源由体外照射人体。生物效应强。如 -ray、中子、X-ray。内照射：
29、放射性物质通过某种途径进入人体，以其辐射能产生生物效应者为内照射。如 ray。辐射的确定性效应：辐射的严重程度与照射剂量的大小有关，效应的严重程度取决于细胞群中受损细胞的数量或百分率。如白细胞减少、皮肤红斑脱毛、白内障。随机效应：效应的发生率与照射剂量的大小有关，这种效应在个别细胞损伤时即可出现，无阈剂量。如诱发癌症和遗传效应。16 放射防护的 3 原则是什么？放射实践正当化；放射防护最优化；个人剂量限制。17 外照射防护的基本措施是什么？时间防护、距离防护、屏障防护。18 放射性的“三废”是指哪三废？放射性废气、废液、固废。19 外照射的 ， 和伽马射线应该分别如何防护？ 粒子穿透能力弱，不
30、会引起外照射损伤，纸可阻挡； 辐射常采用低原子序列的铝或有机玻璃；X、 射线常采用高原子序列的铅、铁或经济适用的混凝土等材料；20 医院中使用的 X 光机中有没有辐射源？为什么？没有。高速电子轰击靶物质时，会产生 X 射线。X 光机的核心部分是 X 线管，通常由安装在真空玻璃壳内的阴极和阳极组成。阴极为钨丝，阳极则根据不同需要由不同材料制成多种形状。也就是说，X 光机里没有“密封源”第 3 章 分子杂交技术1 核酸分子杂交的分子基础是什么？核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这就是核酸分子杂交的基础。不要求两条单链碱基顺序完全互补。R
31、NA-RNA, DNA-DNA,DNA-RNA2 举例说明哪些生物反应是属于探针靶反应？a抗原-抗体 b.外源凝集素-碳水化合物 c.亲和素-生物素 d.受体-配基 e.互补核酸间的杂交3 核酸探针的种类有哪些？各有什么特点？A 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类。B 根据探针的核酸性质不同又可分为 DNA 探针，RNA 探针，cDNA 探针及寡核苷酸探针等几类。C DNA 探针还有单链和双链之分各自特点：DNA 探针：最常用的核酸探针；主要特点有： 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽， 1制备方法简便 DNA 探针不易降解。一般可有效抑制 DNA
32、酶活性 DNA 探针的标记方法较成熟，有多种方 2 3法可供选择。(多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列，须是特异的)cDNA 探针：互补于 mRNA 的 DNA 分子(一般都为编码序列)。cDNA 是由 RNA 经逆转录酶催化产生的不含有内含子序列，尤其适合于基本表达的检测。RNA 探针：主要用于研究目的，而不是用于检测。高杂交效率，但也易降解、标记方法复杂（标记效率低） 。寡核酸探针： 链短、序列复杂度低、分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。 寡 1 2核苷酸探针可识别靶序列内 1 个碱基对变化 一次可大量合成寡核苷酸探针，价格低廉，可用酶学或化学 3方法修饰以
33、进行非放射性标记物的标记4 探针标记技术可以分为哪两类？非放射性标记技术(金属 Hg,荧光物质 FITC,半抗原如地高辛,生物素,酶如辣根过氧化物酶)和放射性同位素标记技术( 32P 14.3 天, 35S 87.1 天, 125I 60 天, 3H 12.3 年，其中 32P 最常用)5 核酸探针常用的酶促标记技术有哪几种？缺口平移、DNA 快速末端标记、用 T4 多核苷酸激酶(PNK)标记 DNA5末端、随机引物延伸(DNA 聚合酶或反转录酶)、聚合酶链式反应(PCR，用于大规模检测和非放射性标记)6 缺口平移标记技术的原理是什么？利用了什么酶的哪些？原理：首先用 DNA 酶在双链 DNA
34、 探针分子的一条链上制造一些缺口，缺口处会形成 3-羟基末端，这时再在大肠杆菌 DNA 聚合酶的催化下将核苷酸残基加在 3-OH 上，同时根据该酶的 53核酸外切酶活性，此酶将缺口 5侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移。若用高强度的放射性核苷酸（- 32 PdATP）,即得到被标记的 DNA 探针。酶：DNA 聚合酶的核酸外切酶活性，核酸外切酶水解核苷酸的活性7 DNA 快速末端标记中使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？DNA 快速末端标记中使用的酶：a.Klenow 片段(用于 5延伸端，大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 经枯草杆菌蛋白酶切割得到，有 5-3聚合酶活性；3-5外切酶活性)
35、；b.T4DNA 聚合酶(用于 3延伸端)DNA 快速末端标记中使用的同位素：- 32 PdNTP8 标记 DNA 5末端时使用的酶是什么酶？使用的常用同位素是什么？与 DNA 快速末端标记中使用的有什么不同？标记 DNA 5末端时使用的酶：T4 多核苷酸激酶（PNK）使用的同位素是- 32 PdNTP(来源于 ATP)DNA 快速末端标记中使用的同位素是- 32 PdNTP9 核酸的非放射性标记技术可以分哪几类？两大类：酶促反应标记法(缺口平移,随机引物,末端加尾.敏感度高,产量低,成本高)化学修饰标记法(将标记物用化学反应连于 DNA 分子,成本低,用于大量制备)10 常用的非放射性标记系
36、统中，有哪几种常用的非放射性物质可用来标记核酸分子？a 生物素标记核酸探针法 b 异羟基洋地黄甙 c 光敏生物素d 辣根过氧化物酶e 三硝基苯磺酸(TNBS)核酸分子杂交分：固相杂交(southern,northern,菌落原位杂交,斑点杂交)；液相杂交固相杂交过程：DNA 变性-变性 DNA 在支持物上固定-封闭(预杂交)-杂交-洗膜-结果显示11 Souther 杂交的过程一般分为哪几步骤？(常用醋酸纤维素膜和尼龙膜)DNA 标本用限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段DNA 碱变性,Tris 缓冲液中和高盐下通过毛吸作用将 DNA 转印到硝酸纤维素滤膜上,烘干固定(在凝胶中的相对位
37、置在转移到膜的过程中仍保持着)附于膜上的 DNA 与 32P 标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条 DNA 带动位置12 预杂交的作用是什么？A、防止非特异性杂交，B、封闭试剂13 核酸分子杂交实验的优化一般可以从哪几个方面考虑？1 探针的选择 2 探针的标记方法 3 探针的浓度 4 杂交率 5 杂交最适温度（高温 6058特异性高；低温5055特异性低）6 杂交的严格性 7 杂交的反应时间 8 杂交促进剂第 4 章 cDNA 文库1 什么叫基因组文库？cDNA 文库？有什么区别？基因组文库(genomic DNA library)：指将基因组 DNA 通过限制性内切酶部分酶解后
38、所产生的基因组 DNA片段随机的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组 DNA 所有的序列。cDNA 文库（cDNA library)：指只包括在特定组织或细胞类型中已经被转录成 mRNA 的所有的基因序列。区别： 重组 DNA 片段来源不同基因组文库：来源于某特定生物个体的基因组 DNADNA 文库：来源于细胞中表达出的RNA使用范围不同基因组文库：开展人类基因组计划研究，构建物理图谱等DNA 文库：研究某特定细胞中基因组表达状态及表达基因的功能鉴定2 构建一个理想的 cDNA 文库需要考虑的因素有哪些？acDNA 文库的质量（1）文库的代表性：是指文库中包含的重组 cDNA
39、分子是否能完整地反映出来源细胞中表达的全部信息（即 mRNA 种类），是体现文库质量的最重要指标。（2）重组 cDNA 片段的序列完整性：5端非翻译区，中间的编码序列和 3端非翻译区文库中重组 cDNA 片段尽可能完整的反应出天然基因的结构cDNA 是否完整，对文库使用价值的影响并不是绝对的完整性这一指标要根据研究目的及筛选方法来灵活考虑使细胞中表达出的 mRNA 在构建的 cDNA 文库中尽可能含有相应其各部分序列的重叠 cDNA 片段是其中一种折中的做法。b文库筛选可选择的具体方法决定文库筛选方法的主要因素是 a.构建文库的克隆载体系统；b.相应的宿主细胞系统。最理想的情况是对于具体构建出
40、的一个 cDNA 文库，应能够使用多种筛选方法，有效地分离鉴定出目的基因，从而使研究者能够在已有研究条件上，在文库筛选的具体方法上有灵活的选择余地。3 如何考察确定一个 cDNA 文库的质量？（1）文库的代表性：是指文库中包含的重组 cDNA 分子是否能完整地反映出来源细胞中表达的全部信息（即 mRNA 种类），是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用一个量化的指标来衡量，即文库的库容量，它是指构建出的原始 cDNA 文库中所包含的独立的重组子克隆数。（2）重组 cDNA 片段的序列完整性：在细胞中表达出的各种 mRNA 尽管具体的序列不同，但基本上由三个部分组成，即 5端非翻译区，中
41、间的编码序列和 3端非翻译区4 什么叫文库的代表性？是指文库中包含的重组 cDNA 分子是否能完整地反映出来源细胞中表达的全部信息（即 mRNA 种类） ，是体现文库质量的最重要指标5 什么叫文库的库容量？有什么意义？文库的库容量：它是指构建出的原始 cDNA 文库中所包含的独立的重组子克隆数。意义：它是衡量文库代表性好坏的量化指标。 (至少 106以上的库容量)6 常用来构建文库使用的载体系统有哪些？各有什么特点？1）噬菌体载体系统：构建的库容量最大（适于全长 cDNA 的克隆） ，转染效率最高，有较好的质量控制指标（通过对转染细胞的表现鉴定，如蓝白斑分析） ，适合于 cDNA 文库的长期保
42、持。缺点：采用的文库筛选方法有限，文库中许多的 cDNA 片段在宿主细胞中常常无法获得功能性表达2）质粒载体系统：体外操作方便，在载体本身的设计上有很大的可塑性，可对 cDNA 文库进行功能性筛选缺点，插入片段的载体容量小，因此文库中含有全长 cDNA 的克隆比例少；文库的库容量较小，质粒文库需要以活的转化菌形式保存和扩增，保存条件严格，不适于长期保存。3）噬菌粒载体系统：功能性筛选，缺点同“质粒载体” ，cDNA 文库功能筛选的重要方法4）哺乳类细胞表达载体：侵染的细胞增广；对细胞侵染率高；转染进宿主细胞的重组病毒基因能高频地整合到宿主细胞基因组中。7 构建 cDNA 文库的基本步骤有哪些？
43、制备 mRNA 样品、合成 cDNA 的第一链、双链 cDNA 的转换合成、cDNA 克隆mRNA 纯度对文库质量有影响，借助 3末端 polyA 尾与 oligodT 互补而分离出 mRNA。合成 cDNA 两种方法：a.oligodT 引导；b.随机引物引导。8 对 cDNA 文库进行筛选的策略有哪两种？a.以一个已知的分子作为靶标，通过检测在特定条件下文库中与靶标发生相互作用的基因序列或其编码的表达产物，从而分离出目的基因。b.不需要附加任何先决条件，通过检测在特定条件下来源于两个文库的基因编码产物之间发生相互作用的情况，从而确定出这两个文库中所有可能在生理上发生相互作用的基因对，描绘出
44、某一特定类型细胞内表达出的基因之间发生的基因相互作用的联络图。9 使用核酸杂交方法筛选 cDNA 文库时使用的探针有哪几种？1.同源探针(差异显示技术，EST 数据库)2.简并性寡核苷酸探针 3.cDNA 探针10 对表达文库(基因编码 Pr 特异性)进行高通量的功能性筛选有哪几种方法？1.噬菌体表面展示系统 2.酵母双杂交系统 3.酵母单杂交系统11 噬菌体表面展示技术的原理是什么？利用大肠杆菌丝状单链 DNA 噬菌体(fd 或 M13)作为载体,在重组噬菌体颗粒表面展示外源多肽分子.外源蛋白在噬菌体表面上展现,是通过外源蛋白在宿主大肠杆菌分泌性表达过程中与丝状噬菌体外膜结构蛋白(如主要外膜
45、蛋白 P8 和次要外膜蛋白 P3)形成牢靠的复合物而得以实现.方法一:通过基因重组操作,构建外源基因与噬菌体外膜蛋白基因的融合基因,直接产生出外源蛋白与外膜结构蛋白的嵌合分子.外源 Pr C 端与 P3/P8 N 端；外源 N 端与 P6 C 端。方法二:在表达基因的构件上,分别使表达出的噬菌体结构蛋白 P3 或 P8 的 N 端和外源蛋白的 C 端分别融合上一种短的介导蛋白质相互作用的功能结构域.如亮氨酸拉链12 酵母双杂交系统（两个 Pr 相互作用）的原理和主要功能是什么？一般由哪几部分组成？原理:在这一系统中,与诱饵蛋白融合的 DNA-BD(DNA 结合域)和与文库猎物蛋白融合的 AD(
46、转录激活域)均来自 GAL4 相应的结构域.将诱饵蛋白与猎物蛋白的编码质粒分别导入同一个 GAL4 缺失的酵母细胞中,通过两种相互作用蛋白结合形成复合物,可以重建 GAL4 的活性,转录激活相应的效应基因.三个基本组成部分:1.编码靶蛋白与 DNA 结合域融合蛋白的表达质粒.这种靶蛋白在双杂交系统中专称诱饵蛋白;2.cDNA 质粒表达文库,文库 cDNA 表达出的蛋白与转录激活域形成融合蛋白,这些蛋白统称为猎物蛋白;3.能反映出体内转录因子活性重建的宿主酵母菌及体现出这种活性的报道基因系统.13 酵母双杂交体系常常出现假的阳性结果，应该如何正确判读得到的结论呢？ (缺点是假阳性)(优点是功能性
47、筛选，体内筛选系统)1) 用不同的报道基因系统的双杂交实验来重复筛选2) 通过在体外检测诱饵蛋白与猎物蛋白在体外的相互作用情况，如免疫共沉淀3) 基于生物学知识判断两蛋白是否会在生物细胞中发生相互作用4) 查询前人是使用酵母双杂交系统时总结的经验14 酵母单杂交系统（Pr 与 DNA 相互作用）的原理和主要功能是什么？原理：与双杂交系统一样，也是利用了真核转录因子的 DNA-BD 和 AD 两个功能结构域的可分离性。 （文库cDNA 与转录因子 AD 区融合；诱饵不是某已知 Pr 而是任一短的双链 DNA）功能：是 cDNA 文库筛选的另一种方法，主要用于从 cDNA 文库中筛选出与特定 DNA 序列结合的蛋白基因，如转录因子等基因表达调控因子，是目前分离这些蛋白基因最有效和可靠的方法。
