1、血清中视黄醇结合蛋白免疫透射比浊测定法王晓蓉(上海电力医院 上海 200052)摘要：目的 对视黄醇结合蛋白免疫透射比浊测定法进行方法学和临床应用评价。方法 采用免疫透射比浊测定法，根据 NCCLS 相关文件，对方法进行精密度、线性、准确性等评价及临床初步应用。 结果 批内 CV 1.5%2.2% ，批间 CV 2.8%3.7% ，日间 CV 2.6%3.1% ，总 CV 4.5%6.7% ，线性范围 0至 210 mg/L , r =0.9985 ,对照组血清视黄醇结合蛋白含量：49.511.9 mg/L；糖尿病肾病组：81.012.8 mg/L；慢性肾小球肾炎组：133.822.8 mg/
2、L；急性肾小球肾炎组：175.445.2 mg/L；慢性肾功能衰竭：88.430.7；肾病组与对照组有显著差异（P 0.01） 。结论 免疫透射比浊法测定血清视黄醇结合蛋白，方法简便、快速、灵敏，结果准确，可用自动分析仪测试，适合临床检验科应用。对肾脏疾病的早期诊断有一定临床意义。关键词 视黄醇结合蛋白 免疫透射比浊法 肾功能Turbidimetric Immunoassay for determination of Retinol Conjugated Protein in SerumXiaorong Wang . ( Shanghai Power Hospital ，Shanghai, 2
3、00052，China)Abstract：Objective: To evaluate the methodology and clinical application of turbidimetric immunoassay for determination of retinol conjugated protein in serum. Method: According to NCCLS relative documents, evaluate the precision, linearity and accuracy of this turbidimetric immunoassay
4、and try a clinical application. Results: within-lot CV 1.5%-2.2%, between-lot CV 2.8%-3.7%, between-day CV 2.6%-3.1%, total CV 4.5%-6.7%, linearity range 0-210mg/L, r = 0.99985. Quantity of retinol conjugated protein in Compared Group: 49.511.9mg/L; Diabetic Renopathy Group: 81.012.8mg/L; Chronic Gl
5、omerulonephritis Group: 133.822.8mg/L; Acute Glomerulonephritis Group: 175.445.2 mg/L； Chronic Renal Failure Group: 88.430.7mg/L. Theres obvious difference between the kidney disease Group and the Compared Group. (P 0.01) Conclusion: The method to determine retinol conjugated protein by turbimidetri
6、c immunoassay is simple, quick, sensitive, and accurate-resulted. So it can be applied on automated analyzer in clinical testing laboratory. Also it has certain clinical significance for the preliminary diagnosis.Key words: Retinol Conjugated Protein Turbidimetric Immunoassay Renal Function 人视黄醇结合蛋白
7、（Retinol binding Protein , RBP）分子量约 21,000 ，半衰期 312h，等电点PH4.44.8，由肝细胞合成，分布在人的血清、脑脊液、尿液等 1。在血液中，RBP 与视黄醇（VitA） 、甲状腺素转运蛋白按 1：1：1 结合，以复合物形式存在，能携带 90%视黄醇，从肝脏向周围组织运送，当视黄醇与靶细胞受体结合后，视黄醇即进入细胞内，RBP 便于甲状腺素转运蛋白分离。游离 RBP 经肾小球滤出，被近端肾小管上皮细胞重吸收分解，少量由尿液排出 2，因此肝脏和肾脏疾病均可影响RBP 在血清中浓度。目前测定视黄醇结合蛋白的方法有放射免疫测定法、酶联免疫法等 3，我们
8、建立的是免疫透射比浊法，经方法学评价具有简便快速较高灵敏度、重复性和准确性，适用于各类自动生化分析仪并在临床上初步应用有一定的意义。现报告如下：材料与方法1对象：11 对照组：均为我院健康体检者 50 例，年龄 2062 岁，女 23 例，男 27 例。经 B 超、心电图和临床各项检查排除肝病、肾病、冠心病、高血压、肿瘤、糖尿病等病史和疾病。_作者简介：王晓蓉，女，1969 年生，毕业于上海第二医科大学，主管技师.12 临床病例组：按第二届全国肾脏病学术会议的肾脏疾病的临床分类 17 例急性肾小球肾炎患者，23例慢性肾小球肾炎患者， 22 例糖尿病性肾病患者，10 例慢性肾功能衰竭,共 72
9、例,均为本院门诊或住院病人。2原理：采用羊抗人视黄醇结合蛋白特异性抗体，与血清中视黄醇结合蛋白结合成抗原抗体免疫复合物，使反应液产生一定浊度，该浊度的高低在一定量抗体存在时与抗原的含量呈正比。测定吸光度值，计算血清中 RBP 含量。3仪器：日立 7060 型全自动生化分析仪4试剂：上海北加生化试剂有限公司 试剂盒批号 20030609 产品标准号 Q/TCFF10-2003 产品注册号 国食药械（试）字 2003 第 3050351 号液体型双试剂：R1 ：磷酸盐缓冲液 PH 7.0-7.4 ，聚乙二醇 6000 R2 ：磷酸盐缓冲液 PH 7.0-7.4， 羊抗人 RBP 抗血清（美国 MA
10、YSUN 公司进口）5方法： 免疫透射比浊法（终点法） ，样品血清 3ul 加试剂 R1 250ul，37 5 min ，再加 R2 50ul，延迟 20 秒读空白吸光度 A1 后， 5min 读终点吸光度 A2 。 6计算：RBP (mg/L) = 样品吸光度(A 2-A1) / 校准吸光度(A 2-A1) * 校准浓度7统计分析：采用 Microsoft Excel 97 和 SPSS 9.0 for Windows 软件进行数据统计分析。浓度用 XS 表示显著性测验用成组 t 检验实 验 与 结 果1试剂空白吸光度值：用生理盐水作样本，按测定方法，重复测定 3 次，取平均吸光度，空白吸光
11、度0.05A2精密度：按 NCCLS EP5-T2 文件，取高、低 2 个不同浓度的 RBP 血清标本，每天上下午各测一次，每次测定均作双份，结果见表 1：表 1：RBP 免疫透射比浊法精密度试验结果（ n=20）样品 均值 mg/L 批内 CV% 批间 CV% 总 CV%1 32 22 37 672 87 15 28 453线性：按 NCCLS EP6-P 文件，取 20mg/L、40mg/L、60mg/L 、80mg/L 、120mg/L 五个不同浓度的标本，分别连续测定 4 次。结果显示，y=0.9937x + 0.467 ，r =0.9998。稀释变异试验 P = 0.39，界限值 P
12、0.05 = 0.6841，P0.05，线性失拟检查 G = 2.916 ，界限值 F0.05 =3.29，G F0.05 ，由此可见在 120mg/L 的范围内线性良好。4最低检测浓度：用生理盐水作样本，重复测定 20 次，用 2S 计算最低检测浓度为 0.1mg/L5回收实验取一只新鲜血清，分别加入等量的高、中、低三个浓度的新鲜血清，作回收试验，结果见表 2。表 2：RBP 回收试验( mg/L)样本 测定浓度 加入浓度 回收浓度 回收率%1 32.8 - - -2 48.6 16 15.8 98.753 68.4 35 35.6 101.714 82.5 51 49.7 97.45平均回
13、收率 99。3%6特异性与 1- 微球蛋白，2-微球蛋白，转铁蛋白无交叉反应。7参考值参考值 RBP（ S）为 49.511.9mg/L,无年龄、性别差异。临 床 应 用肾病：测定急性肾小球肾炎，慢性肾小球肾炎，糖尿病性肾病和慢性肾功能衰竭血清视黄醇结合蛋白，发现 RBP 水平均升高。经过统计处理，结果显示肾病组 RBP 均明显高于正常对照组，P0.01，结果见表3。表 3：肾病患者血清 RBP 水平与对照组的比较(mg/L)n RBP t 值 P对照组 50 49.511.9糖尿病性肾病 22 81.012.8 1.39 001慢性肾小球肾炎 23 133.822.8 2.51 001急性肾
14、小球肾炎 17 175.445.2 5.12 001慢性肾功能衰竭 10 88.430.7 1.98 001讨 论1RBP 测定，方法颇多，我们建立 RBP 免疫透射比浊法，是基于免疫比浊法操作简单，仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。从重复性、线性等方法学评价的实验结果显示，与其他测定方法比较本方法简便快速、灵敏可靠，适用于自动生化分析仪，有较大的实用价值。2人类在生理状态下，肾小球基底膜有孔径屏障和电荷屏障。肾脏对保持血清视黄醇结合蛋白水平起重要作用，低分子量的蛋白质，包含游离 RBP，能被肾小球滤过，而 RBP-PA 结合能保护 RBP 不被滤过 4 。因此，正常人 RB
15、P 完成转运视黄醇至靶细胞后即能被肾小球滤过， ，但绝大部分在近曲小管重吸收和分解，尿中排泄量甚微，使血清中 RBP 水平稳定 5。3.在糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎等各种肾脏疾病,早期均有使肾小球滤过率降低和肾血流量降低 6。血液中的 RBP 浓度升高随着病情进展，慢性肾小球肾炎，糖尿病性肾病同时有肾小管损伤，出现尿蛋白。尿 RBP 流失可以影响血清 RBP 水平，因此肾脏疾病有不同的血清 RBP 水平。这正解释了急性肾小球血清RBP 高水平出现。4正常人尿中 RBP 含量很少，约为 0.1ug/min 以下，其排量增加被认为是一种敏感的近端肾小管损伤的诊断指标。RBP 与尿白蛋白、 NAG
16、、B 2-MG 等有显著的正相关。且尿 RBP 作为肾小管损伤的指标较NAG 敏感。在疾病状态下，尿 RBP 浓度是 NAG 的 10 倍。在碱性环境中较 B2-MG 稳定，在 37温度下亦不分解，而 B2-MG 在 PH5.5 以下时迅速分解，室温放置 2 小时后，有 80%会被分解掉 7。因此，尿 RBP 的测定比 NAG 和 B2-MG 更有价值。结 论免疫透射比浊法测定血清中的 RBP 是一种较灵敏和特异的方法，试剂国产化，操作方便，适用于各类自动生化分析仪，而血清视黄醇结合蛋白可以作为鉴别肾脏疾病的早期诊断敏感指标，再加上其他诊断指标进行联合检测能增加对肾脏疾病鉴别有一定的临床意义。
17、参 考 文 献1 Naylor HM, Newcomer ME. The structure of human retinal-binding protein (RBP) with its carrier protein transthyretin an interaction with the carboxy terminus of RBPJ. Biochemistry,1999, 38; 2647-2653.2 Blaner Ws. Retinol-binding protein: the serum transport proteiu for Vifarmin AJ. Endocr Re
18、v, 1989,10:308-3163 金宏 高兴兰 王宗印等，酶联免疫双抗体法测定血清中视黄醇结合蛋白 J 营养学报 1995，17（3）：327-3294 Frank Rees Smith and Dewitt S. Goodman 1971. The Effects of Diseases of the Liver , Thyroid, and Kidneys on the transport of Vitamin A in Human Plasma. The Journal of Clinical Investigation, Volume 50,1971.5 Marino M , A
19、ndrewsd , Brownd, etal. Transcytosis of retinal-binding protein across renal proximal tuble cells after megalin (gp330)- mediated endocytosis J Am. Soc Nephrol . 2001,12:637-6486 Ejal Bosin and Nobuo Monj, 1987. Analysis of Serum and Urinary. Retinol Binding Protein in Hepato-Remal Syndrome. Clinical Biochenistry, Volume 20,February 1987.7Blumschn A . Stablity B2-microglobin and retionl-binding protein at different values of PH and temperation in normal and pathological urine. J. Clin chim. 1990, 195:133.
