1、第九章 色谱法基础,第一节 概述 一、色谱法概述 二、色谱法分类三、色谱法的特点,一、色谱法概述,混合物最有效的分离、分析方法。将待分析样品的各组分一一进行分离，然后依次检测各组分含量。,第一节 色 谱 法 概 述,茨维特（18721919）在1906年创立。俄国植物生理学家和化学家。茨维特应用化学方法研究细胞生理学。1900年他在树叶中发现了两种类型的叶绿素：叶绿素a和叶绿素b，后来又发现了叶绿素c，并分离出纯的叶绿素。,他最重大的贡献是发明分析化学和有机化学中极重要的实验方法色谱法。他的第一篇关于色谱法的论文发表在1903年华沙的生物学杂志上。19061910年的论文都发表在德国的植物学杂
2、志上。在这几篇论文中，他详细地叙述了利用自己设计的色谱分析仪器，分离出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素。由于他的论文发表在不大知名的期刊上，所以当时没有引起化学界的注意。直到1931年，R.库恩才发现茨维特所发明色谱法的重要性，此法才得到普遍的推广和应用。,（动画）,色谱法是一种分离技术；装CaCO3的玻璃柱叫色谱柱；其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱柱中的两相间不断进行着的分配过程。,色谱法的实质是分离，它是根据混合物各组分在互不相溶的两相固定相与流动相中吸附能力、分配系数或其它亲和作用性能
3、的差异作为分离依据的。当混合物各组分随流动相通过固定相时，在流动相与固定相之间进行反复多次分配，使吸附性能或分配系数有微小差别的物质，在移动速度上产生较大差别，从而得到分离。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,（动画）,A.J. P. MARTIN 和R.L.M. Synge,在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J. P. Martin(马丁)和R.L.M. Synge(辛格)，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。,色谱法的发展历史,色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作
4、,二、色谱法分类,1. 按流动相和固定相的物理状态分类,流动相,气 体,液 体,超临界流体,气相色谱 （GC）,液相色谱 （LC）,超临界流体色谱 （SFC）,气固色谱（GSC）,气液色谱（GLC）,固定相,分离依据,固体吸附剂,吸附,液体,分配,液固色谱（LSC）,液液色谱（LLC）,固体吸附剂,吸附,液体,分配,supercritical fluid chromatography,2. 按固定相的固定方式分类,固定相装于柱内的色谱法,柱色谱,平板色谱,固定相呈平板状的色谱法,纸色谱,薄层色谱,3. 按分离过程的机制分类,吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组分的物理吸附性能差异,分配色谱：利用不
5、同组分在两相分配系数不同,离子交换色谱：利用离子交换原理,排阻色谱：利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用,不足之处：被分离组分的定性较为困难。,三、色谱法的特点,（1）分离效率高,复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。,（2） 灵敏度高,可以检测出10-1110-13 g 的物质量。,（3） 分析速度快,一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。,（4） 应用范围广,气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。,蛋白质中含有碳、氢、氧、氮、硫等元素。其中，氮元素极为特别：氮在绝大多数蛋白质中含量相当接近，一般为1517，平均
6、值为16左右。因此，丹麦化学家约翰凯达尔很巧妙地想到，既然氮元素含量稳定，只要准确测量出氮的含量，便能推算出其蛋白质含量。发表于1883年的此方法，无疑为蛋白质的检测做出了巨大贡献。而凯氏定氮法亦有不足之处。最大的问题在于这种方法只能检测氮含量，并不能鉴定蛋白质真伪。不难想象，只要加入含氮量高的物质，就可以骗过凯氏定氮法，轻松获得“高蛋白含量”的称号。,以三聚氰胺为例，其分子式由3个碳原子、6个氢原子和6个氮原子组成，氮含量高达66.7。而牛乳蛋白氮含量只有15.7，大豆蛋白氮含量也仅有16。毋庸置疑，在氮含量比较上，三聚氰胺胜出。难怪，有人把三聚氰胺称做“蛋白精”。,三聚氰胺具有轻微的生物学
7、毒性。早在1945年，美国纽约里德勒实验室两位毒理学专家便发表论文指出，长期给大鼠、兔和狗喂食大剂量三聚氰胺后，会造成其生殖、泌尿系统的损害，以及膀胱、肾部结石，并可以进一步诱发膀胱癌。,国家标准规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法三种方法为三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为2毫克/千克、0.05毫克/千克和0.01毫克/千克。标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。,岛津 气相色谱仪,Clarus 500 美国 PE 气相色谱仪,大连 气相色谱仪,南京 HPLC液相色谱,第九章 色谱法基础,一、色谱流出曲线二、色谱曲线有关术语,第二节 色谱流
8、出曲线及有关术语,无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。稳定的基线基线噪声基线漂移,一、色谱流出曲线（或色谱图）,试样各组分经色谱柱分离后，从柱后流出进入检测器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电压（或电流）信号，再由记录仪记录下来。所得的电信号强度随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线，即色谱图。,1. 基 线,2. 峰 高,色谱峰顶点到基线的垂直距离，以h表示。可用mm ,mV，mA表示，常用的是mV。,二、色谱曲线有关术语,（动画）,3. 保留值,(1). 用时间表示的保留值,保留时间（tR）,从进样开始到色谱峰出现极大值时所需的时间；组分的保留时间就是它通过色谱柱所需的时间，也
9、就是组分在柱内运行的时间。,死时间（t0）,不被固定相保留的组分，从进样到出现峰极大值所需要的时间。实际是流动相流经色谱柱所需时间，或组分在流动相中消耗的时间。,对气相色谱，t0指从进样到空气峰（对热导检测器）或甲烷峰（对氢火焰检测器）最高点所经过的时间。,调整保留时间（tR）,组分的保留时间与死时间的差值。实际是组分被固定相滞留的总时间，反映了组分与固定相之间的作用。,保留体积（VR）,从进样开始到色谱峰出现极大值时所通过的流动相的体积。,死体积（V0）,不被固定相保留的组分，从进样到出现峰极大值所消耗的流动相体积。,调整保留体积（VR）,保留体积与死体积之差，即组分停留在固定相时所消耗的流
10、动相体积。,各种保留时间受流动相流速的影响，各种保留体积与流动相流速无关。,(2). 用体积表示的保留值,tR= tRt0,习惯上，tR2 tR1，故 1，标志两峰在色谱图中的相对位置。相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,4. 相对保留值（选择性因子，r21 或）,组分2与组分1调整保留值之比：,1. 基准组分，可以是被测物中某一指定组分，也可人为配制； 2. 组分,色谱分离是基于试样中各组分在两相间平衡分配的差异。平衡分配可用分配系数和容量因子表征。,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： （1）峰底宽(W)：色谱峰两边转折点
11、所画切线与基线相交截距； （2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度 ； （3）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。,5. 峰宽（或区域宽度）,W=4 ，W1/2 =2.354 ,色谱流出曲线上的信息根据色谱峰的个数，可以判断样品含有组分的最少个数；根据色谱峰的位置（保留值）可以进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析；根据色谱峰的展宽程度，可以对某物质在实验条件下的分离特性进行评价；色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。,第九章 色谱法基础,一、分配系数K和分配比k二、塔板理论三、速率理论,第三节 色谱法基本原理,一、分配系数和分配比
12、,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用 K 表示，即：,K除了与温度、压力有关外，还和组分的性质、固定相和流动相的性质有关。分配系数是色谱分离的依据。不同组分的分配系数的差异，是实现色谱分离的先决条件，分配系数相差越大，越容易实现分离。,1. 分配系数（partion factor） K,例：组分A、B在某气液色谱柱上K分别为495，467，哪个先出峰？,分配系数 K 的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固
13、定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,2.分配比 k,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3. 分配比可以由实验测得。 k值越大，保留时间越长；k=0的组分，其保留时间即为死时间。,分配比 （partion radio）也称：容量因子（capacity fa
14、ctor） 、容量比,3. 容量因子与分配系数的关系,式中为相比。填充柱相比：535；毛细管柱的相比：50200。容量因子越大，保留时间越长。Vm为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积, Vm V0 ；VS为固定相体积；,4. 容量因子与保留值的关系,上式也可写为,（有物料平衡导出）,注意,5. 分配系数K及容量因子k与选择性因子的关系,6. 分配系数K与保留值的关系,当某一组分的色谱峰最高点出现时，说明该组分恰好有一半的量洗脱在VR体积的流动相中流出柱子，其余一半仍留在柱内，即留在柱内的流动相（体积为Vm）与固定相（体积为Vs）中。根据物料平衡原理，得,两边同除cm,Vm V0,色谱过程
15、的基本方程，将反映色谱行为的保留值与反映物质性质的热力学常数K联系起来。,二、塔板理论,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质） 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）,两种色谱理论：塔板理论和速率理论；,1. 塔板理论（plate theory）- 柱分离效能指标,半经验理论；将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成是由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间被固定相占
16、据，另一部分空间被流动相占据。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。,塔板理论的假设：（1）在每一个小段内，平衡可以迅速达到；（2）将载气看作成脉动（间歇）过程；（3）试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；（4）每次分配的分配系数相同。,理论塔板高度H ：理论塔板数 n ：色 谱 柱 长 ：则三者的关系为：,使组分在柱内两相间达到一次平衡分配所需的柱长；,组分流过色谱柱时在两相间进行平衡分配的次数；,L；,塔板理论指出：,溶质在柱中的平衡次数，即n50时，可得到基本对称的峰形曲线。 试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数由微小差异，经过反复多次的分配平衡后，就可获得良好的分离。 由塔板
17、理论推导出的理论塔板数n的计算公式为：,扣除死时间，将有效塔板数n有效作为柱效能指标：,注意：同一色谱柱对不同物质的柱效是不同的。因此说明柱效时除应注明色谱条件外，还应指出是用什么物质测量的。同理，比较不同柱子的柱效时，必须把操作条件固定下来，用同一种物质通过不同的色谱柱，从所得的色谱峰分别计算n有效，该值，柱效。,例：已知一根长1m的色谱柱的n有效为1600块，组分A在该柱上的调整保留时间为100s，试求A峰的半峰宽及有效塔板高度。,解：,例：在2m长的色谱柱上，测得某组分保留时间为6.6min，峰底宽0.5min，死时间1.2min，载气体积流速为40mLmin-1，固定相体积为2.1mL
18、，求：（1）分配比 k；（2）死体积 V0；（3）调整保留体积 VR；（4）分配系数 K；（5）有效塔板数；（6）有效塔板高度（流动相体积即为死体积）。,解：,分配比 k=tR/t0=(6.6-1.2)/1.2=4.5 死体积 V0=t0F0=1.240=48 (mL) 调整保留体积 VR=tRF0=(6.6-1.2)40=216(mL) 分配系数 K=k=k(Vm/Vs)=4.5(48/2.1)=103 有效塔板数 neff=16(tR/W1/2)2=16(6.6-1.2)/0.52=1866 有效塔板高度 Heff=L/neff=21000/1866=1.07(mm),塔板理论的特点和不足
19、,（1）当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,（2）不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,（3）柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,（4）塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；A、B、C三项各与哪些因素有关？,三. 速率理论（rate theory）- 影响柱效的因素
20、,A：涡流扩散项； B：分子扩散系数； C：传质阻力项系数；：流动相平均线速度（cms-1）,1956年，荷兰学者Van Deemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程的动力学理论-速率理论。,1. 涡流扩散项 A（多径项）,A = 2dp,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,（动画）,(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;(2) 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;(3) 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散;(4) 扩散系数：Dg (M载气)-1/2 ； M
21、载气，B值。,2. 分子扩散项 B / （纵向扩散项）, ：弯曲因子，反映固定相颗粒的几何形状对分子扩散的阻碍情况，1。Dm：组分分子在流动相中的扩散系数（cm2s-1） P177有误,B = 2Dm,（动画）,减小分子扩散项u 采取措施： 适当提高流动相流速u，减小保留时间 用相对分子质量较大的载气作流动相。Dg B2Dg 适当降低柱温c。,k为容量因子； Dm 、Ds为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,C =（Cm + Cs）,3. 传质阻力项 Cu,（动画）,气相色谱,为提高柱效，小，应注意以下几点： ）采用适当小而均匀的载体，柱填充应均匀。 ）固定液液
22、膜薄而均匀，并且不宜流失。 ）载气流速小的时候，u是影响的主要因素，选r大的载气，如；载气流速大的时候，Cu是影响的主要因素，选r小的载气，如H2，Ne。 ）采用适当的柱温。,4.流动相流速与柱效最佳流速,流动相流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。 流动相流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效 。,H - u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应流动相流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,将上式代入范第姆特方程得：,实际工作中，为了缩短
23、分析时间，往往使流速 稍高于最佳流速。,速率理论的要点,（1）组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。,（2）通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,（3）速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。,（4） 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,第九章 色谱法基础,
24、一、分离度二、基本色谱分离方程式,第四节 分离度与基本色谱分离方程式,一、 分离度,塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素；区域宽度 色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：, 柱效较高, K 较大, 完全分离； K 不是很大, 柱效较高, 峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低, K 较大, 但分离的不好； K小, 柱效低, 分离效果更差。,分离度也称分辨率或分辨度，相邻两峰分离程度的量度。,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达
25、89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,二、 色谱分离基本方程式,设有两个相近的色谱峰A和B，假定两峰峰底宽近似相等。,代入分离度定义式：,1. 柱效n、容量因子k、选择性因子和分离度R的关系,动力学因素项,选择性因子项,容量因子项,2. 分离性能的优化,(1). 提高柱效,提高柱效是提高分离度最直接的有效手段，n=L/H，n，则L ，或H。降低H最有效。,给定色谱柱，可优化操作条件，如改变流动相组成和流速以及色谱柱柱温。 给定固定相，增大柱长。 柱长不变时，设法降低板高H。,(2). 调节、控制容量因子k,k值大一些对分离有利，但并非越大越有
26、利。k10时，k/k+1的改变不大，对R的改变不明显，反而分析时间大为延长。k值的最佳范围是2k10，可得到大的R值。, = 1不分离， ，R。 的微小变化对R影响很大。故增大值是改善分离度的最有利手段。,(3). 提高选择性因子,改变流动相组成 降低柱温 绝大多数与柱温成反比，降低柱温，升高 改变固定相（增大的最有效方法是选择合适的固定液。）,例 题 ：,在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，塔板数为3600块，柱长1m。计算分离度。要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。,分离度：,解：,例：两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63
27、min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30 min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。试问： 1）柱分离度R； 2）柱的平均理论塔板数nav 3）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？,1）2）3）,06,.,1,min,),21,.,1,11,.,1,(,min,),40,.,16,63,.,17,(,2,R,=,+,-,=,av,2,B,2,A,2,/,),3397,3493,(,n,3397(块),),1.21,63,.,17,(,16,；n,3493(块),),11,.,1,40,.,16,(,16,n,=3445 (块),+,=,=,=,=,=
28、,cm,60,898(30/3445),6,H,n2,L,6898(块),n,n,445,3,5,.,1,06,.,1,；,n,n,R,R,：,，,H,L,k,2,2,2,1,2,1,=,=,=,=,=,=,因此,即,因此可得到,无关,或塔板高度,与柱长,或,a,Q,第九章 色谱法基础,一、色谱的定性分析二、色谱的定量分析,第五节 色谱定性和定量分析,一、色谱的定性分析,1.利用纯物质定性的方法通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。,2.利用相对保留值定性,指组分与基准物的tR的比值，它仅与柱温和固定
29、液性质有关，与其他操作条件无关。因此比保留值定性更方便、可靠。基准物：选取易得到纯品的，而且与被分析组分保留值相近的物质，如：正丁烷、正戊烷、环己烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。,若未知样品较复杂，可将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。注意：当进样量很低时，若峰不重合，峰中出现转折，或半峰宽变宽，则一般可肯定试样中不含有与所加已知纯物质相同的化合物。,3.加入已知物增加峰高法,4.保留指数定性法,柯瓦指数（Kovats）指数，用I表示，表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际公认的定性指标
30、，具有重现性好，标准统一及温度系数小等优点。,测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有n和n1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：,注：同系物组分的I一般为100的整数倍，而除了正构烷烃外，一般其它物质的 I 不等于该化合物的含碳数乘100。,练习：在阿皮松L柱上，柱温100时，测得某组分的tR为310.0mm，正庚烷tR为174.0mm，正辛烷的tR为373.4mm，求组分Ix。,与文献值对照，相同色谱柱及100柱温下，
31、乙酸正丁酯 I =775.6,5.用经验规律和文献值定性,当没有待测组分纯标准样品时，可用文献值定性，或用气相色谱中的经验规律定性。,（1）碳数规律（同系物）大量实验证明，一定温度下，同系物的 lgtR与分子中碳原子数称线性关系，即,（2）沸点规律（同族同碳数异构体化合物）,练习：含n-C10，n-C11，n-C12烷烃混合物，在某色谱条件下流出时n-C10，n-C12的 tR 为10和14 min，求n-C11的 tR 。,A1=0.073， C1=0.27,6.双柱、多柱定性,对复杂样品，组分较多，在一根柱上可能出现两组分有相同的保留值，若使用双柱或多柱，则原来在一根柱上出现相同保留值的组
32、分，在另一柱上就可能出现不同的保留值，从而实现定性。,7.与其他方法结合,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定,二、 定量分析,定量分析依据：操作条件一定时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比，即,定量分析要解决三个问题：准确测量检测器的响应信号 峰面积或峰高；准确求得比例常数 校正因子；正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为 组分的百分含量。,（1）峰高（h）乘半峰宽（W 1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍：A = 1.065 hW1/2 （2）峰高乘平均峰宽法：
33、当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：（3）峰高表示峰面积： （4）自动积分和微机处理法 （5）剪纸称重法,1. 峰面积的测量,痕量分析中，峰高法的准确度较高。峰面积法适用于各种形状的峰，精度较好。,2. 定量校正因子,试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：m i = fi Ai 绝对校正因子：比例系数 f i ，单位面积对应的物质量： f i =m i / Ai相对校正因子f i ：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。,当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（f M）,用表示；当mi、mS用质量单位时, 以（f
34、 m）,表示。,fi测定方法：只与被测物和基准物及检测器有关，与操作条件无关。一般可查文献获得，自己测定时，常用基准物质：热导检测器 苯，氢焰检测器 正庚烷测定时用色谱纯试剂。若无纯品，要确知该物质的百分含量。测定时先准确称量基准和待测物，然后混合进样，分别测A，按上式计算。,（1）归一化法,特点及要求： 归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。,3. 常用的几种定量方法,试样中所有组分的含量之和按100%计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数。,（2）外标法,外标法也称为标准曲线法。,外标法不使用校正因子，准确性较高；操
35、作条件变化对结果准确性影响较大；对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。,特点及要求：,（3）内标法,内标法是将一定量的纯物质作为内标物加入到准确称量的试样中，根据试样和内标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积求出被测组分的含量。,内标物要满足以下要求：试样中不含有该物质，与被测组分性质比较接近，不与试样发生化学反应；出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响；质量与被测物质接近，以保持色谱峰大小差不多。,内标法特点,准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大；ms/m比值恒定，进样量不必准确；适宜于低含量组分的分析，且不受归一法使用上的局限。缺点：每次分析要
36、准确称量内标物和试样的质量，对分离度的要求增高。,色谱法导论小结一.掌握 1.色谱过程、色谱图。2.有关术语：基线、色谱峰、峰高、峰底宽度、半峰宽、峰面积。3.保留值和选择性、柱效率和峰扩展、分离度及分离度公式。4.色谱定性和定量分析方法。二.理解1.塔板理论和塔板、板高和塔板数。2.速率理论和涡流扩散、分子扩散、传质阻力。3.范第姆特方程（速率方程）。三.了解1.色谱分类法、色谱法的发展。2.色谱法分析的特点。,练习,某人制备了一根填充色谱柱，用组分A和B为测试样测得该柱理论塔板数为4500，因而推断A和B在该柱上一定能得到很好的分离，此推断正确吗？简要说明理由。,答：不正确，决定两组份能否分离的关键是热力学参数选择性因子，如果 =1，不管色谱柱柱效如何高，A、B两组份都无法分离。,作业：P188 15、17、21,
