1、主讲：丘秀珍 化学与环境工程学院,第15章 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC),HPLC,高效,应用范围广,高压,高灵 敏度,高柱效,专题 一 高效液相色谱仪,安捷伦 1200,Waters 2695 液相色谱仪,高效液相色谱仪由五大部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统（色谱柱）、检测系统、记录仪,一 高效液相色谱仪的基本部件,1、仪器流程及主要部件,(1) 高压输液系统,高压输液泵高压输液泵是液相色谱仪的关键部件。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。,梯度洗脱就是在分离的过程中式两种或两种以上不同极性
2、的溶剂按一定得程序连续改变它们的比例，从而调节流动相得极性、强度、PH，以到达提高分离效果的目的,(2) 进样系统,通常使用耐高压的六通阀进样装置，,（3） 色谱分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径4.6 mm，柱长100-250mm，标准柱型：1504.6mm 和250 4.6 mm 。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(4)、检测器,目前最常用的检测器主要有：,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：朗伯-比耳定律，AKbC 优点： 1）灵敏度高2）对温度和流速不敏感3）可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,A、紫外检测器,紫外可见光检测器,B、二极管
3、阵列检测器（PDA）- 21世纪标准紫外检测器,1）全波段扫描采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰,二极管阵列检测器的优点,原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 优点： 1）灵敏度极高2）选择性好3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质 可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）,C.荧光检测器,D. 示差折光检测器,通过参比池和样品池中流动相之间的折光率差值来测定组分浓度。差值与浓度呈正比；,优点: 消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗脱，灵敏度高HPL
4、C的通用型检测器，其应用范围将越来越广,E.蒸发光散射检测器（ELSD),原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：对温度变化敏感 主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子,F. 电导检测器,液相色谱的主要类型,专题 二,吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱（凝胶色谱）,按分离机理分,一、液固吸附色谱,（1）吸附机理： 固定吸附剂表面存在分散的吸附中心，进样前，流动相通过色谱柱，溶剂分子S以单分子层的形式占据吸附剂上的活性中心点，进样后，组分分子X与溶剂分子S发生交换：X（液相）+nS(
5、吸附）= X (吸附）+ nS （液相） 其作用机理实质是组分分子与溶剂分子对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附。,极性吸附剂包括硅胶、分子筛及聚酰胺等；中等极性吸附剂氧化铝；非极性吸附剂最常见的是活性炭。,(2) 液固色谱固定相,组分性质和结构与吸附剂相近时，易被吸附。所以吸附色谱对分离几何异构体和不同官能团的物质有很好的选择性，但吸附色谱对同系物没有选择性，不能用该法分离同系物。,（3）液固色谱流动相,能溶解试样，但不与试样发生反应。 与固定相不互溶，也不发生不可逆反应 粘度尽可能小，保证较高的渗透性和柱效 检测器对流动相无响应,液相色谱流动相必须符合的要求：,液液分配色谱是根据各组分在两相中
6、的分配系数不同得以分离的。分配系数（K）或分配比（k）小的组分，在固定相中滞留时间短，先流出色谱柱。,二 液液分配色谱,（1） 液-液分配色谱固定相,化学键合固定相,化学键合固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。,OH,OH,C18 (ODS),强,弱,疏水性 相互作用,疏水性,反相模式下流动相溶剂的选择,优化水（缓冲溶液）和有机溶剂的比例对反相色谱是非常重要的 甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂 在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和PH是非常重要,固定相的影响,分析条件 柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 :
7、 MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm 峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-丙基 苯甲酸 4. n- 丁基 苯甲酸,ODS C8 TMS,3,尺寸排阻色谱法也称凝胶色谱法，是一种根据试样分子大小进行分离的色谱技术。排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。孔穴大小与试样分子大小相当，只允许直径小于孔径的组分分子进入。,四 尺寸排阻(凝胶)色谱法,15.5 HPLC分离方法的选择,15.6 HPLC应用实例,专题四 超高效液相色谱（
8、补充内容，不作考试要求）,超高效液相色谱的发展,站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。,液相色谱40年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。由下图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。,基于1.7 m小颗粒技术的超高效液相色谱（UPLC），并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料，而且需要耐压的色谱系统(15,
9、000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。,UPLCTM与HPLC：分离度比较,填料颗粒尺寸的演变,超高效液相色谱的应用,药物分析 如天然产物中复杂组分的分析 生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品 食品分析 如食品中农药残留的检测 环境分析 如水中微囊藻毒素的检测 其他 如化妆品中违禁品的检测,UPLC仪器,仅仅有小颗粒不能构成UPLCTM,大幅提高色谱柱的性能；第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填料的装填问题。 高压溶剂输送系统（超过15000psi）。 完
10、善的系统整体性设计，降低死体积。并解决超高压下的耐压及渗漏问题。 快速自动进样器，降低进样的交叉污染。 高速检测器。 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题。,检测器：光学及/或质谱检测器可调紫外或光电二极管矩阵为UPLC专门优化的流动池高速检测,色谱柱管理：创新的枢轴转动设计置色谱柱出口直接到检测器,样品管理器：低扩散XYZZ形式快速进样周期低交叉污染样品盘及/或样品瓶可选样品组织器,两元溶剂管理：高压混合两元梯度四溶剂选择在线脱气低扩散设计UPLC的耐压能力,超高效液相色谱的C18色谱柱,固定相粒度直径可达1.7m 色谱柱长可达3-5cm,色谱柱颗粒化学,全二维液相色谱,1
11、HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（ ）A 柱前压力高 B 流速比GC的快C 流动相粘度较小 D 柱温低2在下列方法中，组分的纵向扩散可忽略不计的是（ ）。A 毛细管气相色谱法 B 高效液相色谱法C 气相色谱法 D 超临界色谱法3、在反相色谱法中，若以甲醇一水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间tR的变化为（ ）。A k与tR增大 B k与tR减小C k与tR不变 D k增大，tR减小 4、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（ ） A、恒温箱 B、进样装置 C、程序升温 D、梯度淋洗装置,液相色谱自测题,5在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（ ）
12、是有效的？A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（ ）。A 提高分配系数比 B 容量因子增大C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是A 吸附色谱 B 反离子对色谱C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8. 下列用于高效液相色谱的检测器，（ ）检测器不能使用梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器,9在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（ ）。A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物
13、C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 10. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（ ） A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相和固定相 D、组分与组分 11、吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（ ）。A 液一液色谱法 B 液一固色谱法C 键合相色谱法 D 离子交换法 12. 在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（ ）。A 减小填料粒度 B 适当升高柱温C 降低流动相的流速 D 增大流动相的流速 13在正相色谱中，若适当增大流动相极性则（ ）。A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加C 相邻组分的增加 D 对基本无影
14、响,18、与气相色谱相比，在液相色谱中（ ）。A 分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成B 涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成C 传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成D 速率方程式同样由三项构成，两者相同 19在液相色谱中，下列检测器可在获得色谱流出曲线的基础上，同时获得被分离组分的三维彩色图形的是（ ）。A 光电二极管阵列检测器 B 示差折光检测器 C 荧光检测器 D 电化学检测器 20不同类型的有机物，在极性吸附剂上的保留顺序是（ ）A 饱和烃、烯烃、芳烃、醚 B 醚、烯烃、芳烃、饱和烃C 烯烃、醚、饱和烃、芳烃 D 醚、芳烃、烯烃、饱和烃,21在液相色
15、谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭 22样品中各组分的出柱顺序与流动相的性质无关的色谱是A 离子交换色谱 B 分配色谱 C 吸附色谱 D 凝胶色谱 23在液相色谱中，固体吸附剂适用于分离（ ）。A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的颗粒 C 沸点相差大的试样 D 极性变换范围 24为测定邻氨基苯酸中微量杂质苯胺，选择下面哪种条件A 硅胶固定相，异丙醚一正己烷流动相 B 硅胶固定相，水一甲醇流动相；C ODS键合相，水一甲醇流动相 D ODS键合相，异丙醚一己烷流动相。,解题思路: (1)Rs=2(tR2-tR1)/W1/2(1)+W1/2(
16、2);(2)n=5.54(tR/W1/2)(3)n2=(R2/R1)2n1根据题目给出的已知条件,首先求出A、B组分在色谱图上的半峰宽(或底宽Y),再根据(2),(3)公式进行计算.,13. 组分A和B在某毛细管柱上的保留时间分别为14.6和14.8min,理论踏板数对A和B均为4200,问:(1)组分A和B能分离到什么程度?(2)假定A和B的保留时间不变,而分离度要求达到1.5,则需多少塔板数?,解 根据公式(2)得W1/2(1)=,代入(1)式:,(2)根据公式(3): n2=(1.5/0.37)24200n2=69028块,14 .已知一柱具有如下方程式H=A+B/+C，其中A=0.08cm，B=0.36cm2/s，C=0.043s，求最佳流速；最佳流速所对应的最小塔板高度。,15. 若在1m长的色谱柱上测得的分离度为0.68, 要使它完全分离,则柱长至少应为多少米?解: L2=(R2/R1)2L1 完全分离R2=1.5L2=(1.5/0.68)21m=4.87m,解：速率方程的一阶导数为零时的流速为最佳流速,opt=,
