1、2019/6/21,第11章 高效液相色谱法,11.1 高效液相色谱法概述 11.2 影响液相色谱柱效能的因素 11.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 11.4 液相色谱固定相和流动相 11.5 高效液相色谱仪 11.6 高效液相色谱法的应用 11.7 液相制备色谱,High Performance Liquid Chromatograph,2019/6/21,11.1 高效液相色谱法概述 feature of HPLC,11.1.1 发展和特点：高压、高效、高速、高灵敏度高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,2019/6/21,（1）高压。液在现代液相色谱法中流动相的柱
2、前压力可达150350105Pa，这对于输送高压液体的泵、色谱柱、色谱填料（色谱固定相）及整个流路系统的耐压指标都提出了很高的要求。 （2）高速。流速一般可达110mLmin-1，使得高效液相色谱法所需的分析时间比经典液体柱色谱法少的多，一般都少于1h，而若采用经典色谱法，则往往需要十几个小时。 （3）高效。约达3万块塔板/米，而气相色谱的分离效能则一般仅为2 000块塔板/米。 （4）高灵敏度。采用高灵敏度的检测器，如荧光检测器的灵敏度可达10-11g ，微升数量级的试样就足以进行分析，极大地减少了分析时所需试样量。,2019/6/21,11.1.3 高效液相色谱与气相色谱法的比较,1. H
3、PLC与GC的共同点 （1）气相色谱的理论基本上也适用于高效液相色谱。 （2）定性、定量的原理和方法完全一样。 （3）一样可与其他分析仪器联用. 2. HPLC与GC的不同点 （1）分析对象。 对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大、难气化的有机物），原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析。对于要求柱效达10万块理论塔板数以上的、组成复杂的石油样品，受热易分解、变性的生物活性样品，只能应用高效液相色谱法进行分析，而不能使用气相色谱法进行分析。,2019/6/21,（2）流动相。 气相色谱的流动相为气体，主要起携带组分流经色谱柱的作用，待分离组分几乎不与流动相发生相互作用。对于高效液相色谱而
4、言，流动相的种类较多且选择余地广，组分与流动相有相互作用，流动相的极性、pH等的选择也会对分离起重要作用，可选用两种或两种以上液体作为流动相，从而为提高柱的选择性、改善分离度增加了可调控条件。 （3）操作条件及仪器结构。 气相色谱通常采用程序升温或者恒温加热的操作方式实现不同物质的分离，而高效液相色谱则通常在室温下采取高压的操作方式以克服液体流动相带来的高阻力。与之相适应，高效液相色谱仪的色谱柱通常不需用恒温箱，而且为了提高分离效果，常配有梯度洗脱装置。,2019/6/21,一、影响分离的因素 factors influenced separation 二、液相色谱的柱 外展宽,11.2 影响
5、液相色谱柱效能的因素,factors influenced separation and choice of operation condition,2019/6/21,一、影响分离的因素 factors influenced separation,1. 影响分离的因素与提高柱效的途径在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H = A + C u故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,2019/6/21,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提
6、高柱效。,液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,2019/6/21,讨论：,与气相色谱法的速率方程式一致，只是影响柱效的主要因素是传质项，而纵向扩散项可忽略不计。 要提高液相色谱的分离效率，必须提高柱内填料装填的均匀性、减小粒度、使用低黏度的流动相或适当提高柱温以降低流动相黏度，从而加快传质速率，其中减小粒度是提高柱效的最有效途径。 必须注意到，提高柱温将降低色谱峰分辨率，减小流动相的流速虽然可以降低传质阻力项的影响，但却会使纵向扩散增加并延长分析时间。 色谱分析过程是一个复杂的过程，各种因素相互影响又互相制约。,2019/6/21,2.
7、流速,流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,2019/6/21,11.2.2 液相色谱的柱外展宽,柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起的峰扩展。可分为柱前和柱后两种因素。 柱前峰展宽主要由进样所引起。将试样注入到色谱柱顶端滤塞上或注入到进样器的液流中时，进样器的死体积，以及进样时液流扰动引起的扩展将造成色谱峰的不对称
8、和展宽。若将试样直接注入到色谱柱顶端填料上的中心点，或注入到填料中心之内12mm处，则可减少试样在柱前的扩散，峰的不对称性得到改善，柱效显著提高。 柱后展宽主要由接管、检测器流通池体积所引起。由于分子在液体中有较低的扩散系数，因此在液相色谱法中，这个因素要比在气相色谱中更为显著。为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能地小。,2019/6/21,11.3 高效液相色谱法主要类型与分离原理,一、液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatograph 二、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatograph 三、离子交换
9、色谱 ion-exchange chromatograph 四、离子色谱 ion chromatograph 五、离子对色谱 ion-pair chromatograph 六、排阻色谱 size- exclusion chromatograph 七、亲和色谱(AC) Affinity chromatograph,2019/6/21,一、 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离
10、相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,2019/6/21,二、 液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化
11、学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。,2019/6/21,三、 离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸
12、、核酸等。,2019/6/21,四、 离子色谱 ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。,2019/6/21,五、 离子对色谱 ion pair chromatography,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子
13、分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。,2019/6/21,六、 排阻色谱色谱 size- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分
14、离,2019/6/21,七、 亲和色谱(AC) Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,2019/6/21,一、液相色谱固定相 stationary phase of HPLC 二、液相色谱流动相mobile phase of HPLC,11.4 液相色谱的固定相与流动相,stationary phase and mobile pha
15、se of HPLC,2019/6/21,一、液相色谱固定相 stationary phases of LC,1. 液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量低；,2019/6/21,（3）化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相；a. 硅氧碳键型： SiOCb. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水
16、、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c. 硅碳键型： SiCd. 硅氮键型： SiN,2019/6/21,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；,2019/6/21,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：510 m；,2019/6/21,3.离子交换色谱
17、分离固定相,结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,2019/6/21,4. 空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高
18、流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,2019/6/21,二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC,1. 流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2019/6/21,2. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定
19、组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,2019/6/21,3. 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)
20、,2019/6/21,4. 选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,2019/6/21,11.5 高效液相色谱仪 high performance liquid chromatograph,2019/6/21,液相色谱仪（2）,2019/6/21,液相色谱仪（3）,20
21、19/6/21,液相色谱仪（4）,2019/6/21,流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,流程,四个主要部分： 液体输送系统 进样系统 分离系统 检测系统,2019/6/21,11.5.1 液体输送系统,高效液相色谱仪器的输液系统包括贮液瓶、高压泵、梯度洗脱装置等。 1. 贮液瓶 （1）对贮液瓶的要求。 贮液瓶又称溶剂贮存器，主要用来供给足够数量的符合要求的流动相以便完成分析工作。对于溶剂贮存器的要求是： 必须有足够的容积，以备重复分析时保证供液； 脱气方便； 能耐一定的压力； 所选用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。,2019/6/21,（2）脱
22、气方法。,贮液瓶常用的脱气方法有： 低压脱气法。电磁搅拌、水泵抽真空。 不适于二元以上冲洗剂组成的流动相脱气。 吹氦脱气法。 此法简单方便，适用于所有冲洗剂脱气。 超声波脱气法。 将冲洗剂瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气。方便，不影响溶剂组成，并适用于各种溶剂，目前国内使用较为普遍。 使用此法时应注意避免将溶剂瓶与超声波清洗槽底或壁的接触，以免瓶子破裂。,2019/6/21,2. 高压输液泵,主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、
23、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,（动画）,2019/6/21,3.梯度淋洗装置,高压梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,低压梯度:一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,2019/6/21,11.5.2 进样系统,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,2019/6/21,11.5.3 分离系统,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,2019/6/21,11.5.4 检测系统,a. 紫外检测器
24、应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,2019/6/21,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,2019/6/21,2019/6/21,光电二极管阵列检测器,2019/6/21,c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品
25、池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,2019/6/21,示差折光检测器,2019/6/21,d. 荧光检测器 （fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,2019/6/21,11.6 HPLC的应用 application of HPLC,1. 环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷流 速：1.5 mL/min色谱柱：50
26、cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2019/6/21,2. 稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水 100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流 速：1mL/min柱 温：50 C柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,2019/6/21,11.7、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography,获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；,1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,2019/6/21,2. 液相制备色谱的方法,收集组分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,2019/6/21,3. 制备型液相色谱,制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径2050mm，柱长50cm。,
