1、第17章 核酸技术 Technology of Nucleic Acids,本章主要内容,DNA重组技术 基因鉴定 核酸技术的应用,对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。,一个梦想已成真,生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠”,1 DNA重组技术简介,DNA重组技术是利用多种限制性内切酶和DNA连接酶等工具酶，以DNA为操作对象，在细胞外将一种外源DNA（来自原核生物或真
2、核生物的目的基因）和载体DNA相连接，形成重组载体，然后将重组载体转入宿主细胞（如大肠杆菌, 酵母等），使外源目的基因DNA随宿主细胞的繁殖而扩增（形成无性繁殖系，即克隆，cloning）。外源的目的基因可以在宿主细胞中得到表达获得其蛋白质产物或使生物细胞原有的遗传性状发生改变。这种技术也称为“分子克隆”（molecular cloning）技术。基因重组技术的规模化就是“基因工程”（Genetic Engineering）。,利用重组DNA技术，胰岛素原（proinsulin）的基因在细菌中得到表达的过程,50年来，核酸酶学的进步为DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的核酸工具酶有：DN
3、A聚合酶（DNA polymerase ）klenow 片段， Taq 酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）逆转录酶（Reverse transcriptase）连接酶（Ligase）拓扑异构酶（Topoisomerase）等,DNA重组技术的建立要归功于核酸酶学的发展,限制性核酸内切酶 一把神奇的“手术刀”,具有内切和甲基化两种功能能够识别外源的DNA并将它切开有特异的识别位点，通常为4-8对碱基的旋转对称结构 在其切口处留下黏性末端（sticky end）具有互补序列 的单股链（或平头末端，blunt end）有3种类型，以II型为主例如：EcoRI,属
4、,种,品系,排序,限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端）,2 目的基因克隆的技术路线,1.用限制性内切酶等从基因组获得目的基因（含黏性末端）2.选择合适的目的基因的载体，用同样的限制性内切酶切出缺口（含黏性末端）3.把目的基因插入到载体的缺口中去（黏性末端之间有互补关系），并用连接酶将两者连接得到重组载体4.将重组载体导入宿主细胞进行克隆（通过无性繁殖，目的基因随着宿主的繁殖也扩增）5.利用分子杂交技术，免疫化学技术对重组的克隆进行筛选6.使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因,黏性末端,（如质粒，噬菌体等）,（如细菌）,目的基因克隆的技术路线,利用表型特性，核酸杂交 以及免疫化学
5、等方法对克 隆进行筛选,2.1 目的基因的制备,1. 直接从染色体中分离 2. 用人工方法合成 3. 将细胞的全部mRNA经反转录得到全套cDNA, 然后将其克隆制备cDNA文库（cDNA library）。 4. 将全部基因组DNA的片段进行克隆，得到基因文库（Gene library）。 5. 通过PCR技术扩增出目的基因。,基因文库建立示意图,质粒（plasmid）是常用的基因载体，为双链环状DNA，是可以独立复制并在细菌之间转移的遗传单位，质粒还能赋予宿主菌某种遗传表型，例如对于抗菌素的抗性。,2.2 目的基因的载体（Vector）,四环素抗性基因,青霉素抗性基因,复制起始点,噬菌体（
6、Phage）DNA也可以成为目的基因的载体,2.3 目的基因的插入(重组)与连接外源DNA片段与载体DNA的连接过程即DNA的重组，这一过程是以DNA连接酶为中心的生物化学过程。连接的方式主要有粘性末端连接、平端连接、定向克隆、人工接头连接和多聚核苷酸连接等。关键是目的基因DNA和载体的缺口之间要有互补的黏性末端.连接的原则是：实验步骤简单易行；连接点能被限制酶重新切割而便于回收插入片段；有利于重组，避免载体自身环化；对复制表达过程不产生干扰。,2.4 重组载体的导入与阳性克隆的筛选2.4.1 导入方法将重组质粒导入宿主细胞的过程称转化（transformation）将以噬菌体、病毒构建的重组
7、载体导入宿主细胞称转染（transfection）对不同的宿主，导入目的基因DNA的方法不同。 一般方法有: CaCl2，电穿孔，脂质转染法等,2.4.2 重组体的筛选方法主要依据重组体的表型进行筛选。 重组体的表型特征来自载体和插入的外源DNA两个方面。载体的表型主要指载体携带的遗传标志，包括抗药性标志、营养标志和报道基因 (report gene) 等。抗生素抗性是生物对某种抗生素的耐受性，利用基因插入使抗性基因失活是常用的筛选方法。鉴定目的基因或相应基因产物的方法主要有：核酸分子杂交、免疫学筛选等。,免疫化学法筛选阳性克隆,分子杂交等技术可用来筛选重组克隆,含有目的基因的重组宿主细胞（如
8、细菌）可以通过规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）,基因重组技术的两个基本目的1.直接利用基因主导生长的基因、作物的抗性基因、基因诊断、基因治疗、指纹图谱等2.利用基因的表达产物疫苗、药物、组织激活物、生长因子、珍稀蛋白等,利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股DNA或RNA片段 探针（probe）可以：研究DNA之间的亲缘关系；发现基因的缺失或突变；测定某种遗传信息的量；鉴定某种基因基因治疗等,3 基因鉴定技术原理与应用分子杂交（Molecular hybridization）,分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础印迹技术（ Blotting）Southern blot用探针鉴定DN
9、ANorthern blot用探针鉴定RNA原位杂交（Hybridization in situ）指纹分析（Finger printing）基因芯片（ DNA microarray）,用探针鉴定DNA 称为Southern 印迹,鉴定RNA称 为Northern印迹,Southern-blot印迹杂交原理示意图,染色体的原位杂交,基因芯片的应于 发育生物学研究,在基础研究和应用领域具有广泛用途的DNA 芯片,同一物种不同生态型之间DNA多态性产生的RFLP,DNA指纹（DNA fingerprint）,古埃及一具木乃伊的一个 DNA 片段已经得到克隆打开了人们窥探过去的窗户,聚合酶连锁反应（
10、PCR, DNA polymerase chain reaction ）,目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增一个温度和时间可以控制的反应体系 含有双链DNA模板 耐热的DNA聚合酶（如Taq酶） 一对设计适当的RNA引物，dNTP原料，过量 经“变性-退火-延伸”多次循环使目的DNA得以扩增,DNA核苷酸序列分析,Sanger双脱氧链终止法,从上世纪90年代初开始，用了10年时间，人类完成了 对自身染色体的30亿对碱基的序列测定，这就是所谓 的人类基因组项目（HGP）,3 核酸技术的应用,在生命科学研究中的应用 在动物疾病诊断中的应用 在动物遗传育种中的应用 在生物制药中的应用 在农业中的应用,在人类基因组项目基本完成之后，人类蛋白质组项目将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，控制疾病的意义将难以估量。,课 程 结 束感谢同学们的合作,祝大家考试取得好成绩!,
