基因工程工具酶.ppt

1、2019/4/12,1,基因工程的有力工具酶,基因的重组与分离，涉及一系列相关的酶促反应，其涉及的酶类主要有： 限制性内切酶 连接酶 聚合酶 修饰酶 核酸酶,2019/4/12,2,基因工程中常用的工具酶,2019/4/12,3,第二章 基因工程工具酶,第节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 修饰酶 第五节 核酸酶,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,4,第一节 限制性核酸内切酶,1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、型限制性核酸内切酶的基本特性 5、型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切

2、酶活性的因素,2019/4/12,5,1、宿主的限制和修饰现象,2019/4/12,6,1、宿主的限制和修饰现象,寄主细胞控制的限制与修饰（R/M体系） 宿主控制限制在大肠杆菌K菌株上生长的噬体则表示为（K）。实验表明，用这种（K）噬菌体感染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑的效率就很低，因此我们说（K）噬菌体受到了B菌体的限制。,2019/4/12,7,宿主控制修饰在这些稀有的由（B）形成的噬菌斑中的噬菌群体，则已经发生了某些变化。用这些变化了的（B）噬菌体再感染B菌株，它们就可以在B菌株上有效地生长。如此由第二个寄主菌株（大肠杆菌B株）赋予噬菌体的这种非遗传化，使得它再感染时能够有效地生长，而没有

3、再次受到限制的现象，称之为修饰。 无论是限制还是修饰，都是由寄主控制的，我们统称为寄主控制的限制与修饰现象。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,8,酶切位点 不被修饰,噬菌体DNA 被切割,酶切位点 被修饰 Methylation,基因组DNA 不被切割,1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶； 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。,限制修饰的酶学假说,2019/4/12,9,1.1 限制（Restriction）,宿主DNA中的特

4、定序列被甲基化，无法被自身的限制酶切割分解，而无甲基化的外源DNA将被宿主的限制酶摧毀，即限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,2019/4/12,10,1.2 修饰（Modification）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割 Dam甲基化酶 Dcm甲基化酶,2019/4/12,11,1.3 限制与修饰现象意义,几乎所有的限制性内切酶都要和能识别而且甲基化相同的DNA位点的甲基化酶共同作用。这两个酶限制性内切酶和甲基化酶一起称为限制修饰系统(R-M系统) 。在甲基化后，DNA位点被保护起来，所以宿主细胞中甲基化的DNA能够不被限制

5、性内切核酸酶消化。 寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，它存在有两方面的作用。 保护自身的DNA不受限制 破坏外源DNA使之迅速降解,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,12,第一节 限制性核酸内切酶,1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、型限制性核酸内切酶的基本特性 5、型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,13,2 限制性核酸内切酶的类型,2.1 限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）:是一类能够识别双链D

6、NA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。 2006年2月共发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种,商品化的609种,II型中共有223种特异性。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,14,2.2 限制性核酸内切酶的分类,2.2.1 型限制性酶 最早(1968)发现的一种复合功能酶，具修饰和切割DNA两种特性。 该酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就行使内切酶功能，并在切割DNA的同时或以后转变为ATP酶；如果位点上只有一条链被甲基化，

7、则发挥修饰功能，使另一条链也甲基化；若位点两条链均已甲基化，就与位点解离。,2019/4/12,15,它的显著特点：是能识别DNA分子中特定的核苷酸序列，但切割作用却是随机进行的，一般在距离识别位点上千碱基对以外的随机位置上切割，不产生特异片段。因此，I型限制性核酸内切酶在基因操作中没有实用价值。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,16,2.2.2 型限制性酶,1970从流感嗜血杆菌分离出 特点是只有一种多肽，它与甲基化酶是分开的两种蛋白质。 型限制性核酸内切酶仅需要Mg2+，可识别双链DNA分子上的特定序列，并且其切割位点与识别位点重叠或靠近，产生具有一定长度的DNA片段，因此在基

8、因克隆中广泛使用。以下所称的限制酶均指型限制性核酸内切酶。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,17,2.2.3 型限制性酶,型限制性核酸内切酶是由两个亚基组成的蛋白质复合物，具有限制与修饰双重作用。其中M亚基负责位点的识别与修饰，R亚基具有核酸内切酶活性； 酶的切割作用需要ATP、 Mg2+和S腺苷甲硫氨酸等辅助因子。其修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争，修饰位点在识别序列内，切割位点则在识别序列一侧的若干碱基对处，无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同酶的这一距离不同。 在基因克隆中很少使用型限制性核酸内切酶。,2019/4/12,18,三类限制性核酸内切酶比较,2

9、019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,19,第一节 限制性核酸内切酶,1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、型限制性核酸内切酶的基本特性 5、型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,20,3、限制性核酸内切酶的命名,目前普遍采用的是HO.Smith和D.Nathans (1973)提议的命名系统 1 酶的基本名称:寄主菌属名的第一个字母(大写)和种名的头两个字母(小写)组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，即属名种名株名 如大肠杆菌Escherichia coli 表

10、示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示 Hin； 2 用一个正体字母表示菌株类型，比如EcoR、Hind；,2019/4/12,21,3 如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind 。 4 所有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系统名称。限制性核酸内切酶的系统名称为R，甲基化酶为M。例如R.Hind表示限制性核酸内切酶,相应的甲基化酶用M.Hind表示。但在实际应用中，尤其是在上下文已交代得很清楚时，限制性内切酶的系统名称R常被省略。,2019/4/12,22,属名 种名 株名,Hind III,H

11、aemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,命名举例1,Hind ,2019/4/12,23,命名举例2,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,24,第一节 限制性核酸内切酶,1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、型限制性核酸内切酶的基本特性 5、型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,25,4 型限制性核酸内切酶的基本特性,4.1 识别位点的长度 识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、8bp的。

12、 4bp： Sau3A GA TC 5bp ： EcoR C CWGG W=A or TNci CCSG G S=C or G6bp ：EcoR G AATTCHind A AGCTT,2019/4/12,26,7bp：Ppu M RG GWCCY 8bp：Not GC GGCCGCR= A or G Y= C or T M= A or C K= G or T S= C or G W= A or T H= A or C or T B= C or G or T V= A or C or G D= A or G or T N= A or G or T,2019/4/12,27,（1）回文对称 4

13、6 8 5 7Eco R G AATTCCTTAA G Hind A AGCTTTTCGA A,回文序列（palindrome) 又称回文对称、双重交替式对称，为对称结构的DNA片段，一条链上的碱基顺序（5 3）和另一条链上从5 3的顺序完全相同。如： 5 GAATTC 33 CTTAAG 5,4.2 识别序列结构,2019/4/12,28,（2）非对称AccBS CCG CTC（-3/-3）BssS C TCGTGGAGCA C,Numbers in parentheses indicate point of cleavage for non-palindromic enzymes,（3）多

14、识别位点（简并序列）Acc GT MKACHind GTY RAC （4）间断对称AlvN CAGNNNC TGDde CT NAG,2019/4/12,29,（1）内部 大多数AccBS CCG CTC（-3/-3）GGC GAG Aaaa NNNN NN（-2/-4）NN NNNN （2）两端EcoR CCWGGSau3A GATCNla CATG,4.3 切割位置,2019/4/12,30,（3）两侧Bcg （10/12）CGA（N）6TGC（12/10）（N） 10 CGA（N）6TGC（N）12（N） 12 GCT（N）6ACG（N）10TspR CASTGNN/NNCAC（G）TG

15、NNNNGTG（C）ACNN,（4）单侧 Bbv GCAGC N（8/12） BspM ACCTGC（N4）TGGACG（N8）,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,31,4.4 限制性内切酶产生的末端,双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。,2019/4/12,32,非对称突出端（相同） （1） 来自非对称识别序列 CC TCAGC BbvC GGAGT CG,GTATAC GTAGAC GTCTAC GTAGAC,（2）简并序列Acc GT/MKAC,2019/4/12,33,同裂酶与同尾酶,同裂酶(isoschizomer):

16、不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。SmaI和XmaI(CCCGGG)。 同序同切 Hind 与Hinc GTY/RAC 同序异切 Kpn GGTAC / C Acc65 G / GTACC Asp718 G / GTACC Aat GACGT / C BsaH GR / CGYC,2019/4/12,34,同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。BamHI(GGATCC)和Bgl(AGATCT)。 注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两

17、种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。,2019/4/12,35,4.5 型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能,与型和型限制性核酸内切酶不同，型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。,2019/4/12,36,4.6 型内切酶可以对单链DNA的切割,虽然限制性核酸内切酶定义为切割双链DNA特异位点的酶，但实际上仍有一些限制性核酸内切酶，除双链DNA外，还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低。,2019/4/12,37,4.7 星号活性(star activity),Star活性 ：限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性

18、可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。或者说在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列，降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星号活性。,2019/4/12,38,（1）星活性产生的原因,反应体系中甘油的浓度大于5%。酶用量过大，大于100U/微克DNA。低离子强度，小于25mmol/L。高pH，大于8.0。含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙、酰胺等。Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在或用以上阳离子代替Mg2+。 常发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind

19、、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。,2019/4/12,39,以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoRI比 PstI对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。,2019/4/12,40,（2）抑制星星活性的条件(措施),尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。 尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。 将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。 将反应缓冲液的pH值降到7.0。 使用Mg+作为二价阳离子。 大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下，使用随酶提

20、供的Buffer，相应的酶就不会出现星号活性。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,41,第一节 限制性核酸内切酶,1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、型限制性核酸内切酶的基本特性 5、型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,42,5 型限制性核酸内切酶的酶切反应,5.1 标准酶解体系的建立酶活性单位的定义：在合适的强度和缓冲液中，在20ul反应体系中1h完全降解1ugDNA所需要的酶量为一个单位的限制性核酸内切酶活性（用u表示) 。对于大量DNA的酶解，反应体积可按

21、比例适当扩大，加人过量的酶，可以缩短反应时间并达到完全酶解的效果，但是加入的酶过量，其贮存液中的甘油会影响反应，而且许多限制性核酸内切酶过量可导致识别序列的特异性下降，所以一般推荐稍过量的酶（25倍）和较长的反应时间。,2019/4/12,43,酶切体系的建立,酶解体系在保证酶液体积不超过反应总体积10的前提下，尽量减小反应总体积。一般是在反应体系的其他成分加入以后，最后加酶。,Buffer (10X) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L（25u） Volume 20.0 L,2019/4/12,44,常规缓冲液,pH, Mg+, DTT, BS

22、A（10X） （1）pH 7.0-7.9（at 25）Tris-Cl，乙酸 （2）离子强度NaCl 高 中 低100mM 50mM 0,2019/4/12,45,（3）Mg+ MgCl2或 MgAc， 10mM （4）DTT（二硫苏糖醇, dithiothreitol ） 1mM （5）100g/ml BSA 少数需要 （6）乙酸盐缓冲液,2019/4/12,46,5.2 酶切反应的基本步骤,电泳鉴定,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10X) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L Volume 20.0 L,1.0kb,1

23、.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,T,终止反应,2019/4/12,47,5.3 终止反应常用方法,若DNA酶切后不需进行进一步的酶反应时： （1）加EDTA：可加入乙二胺四乙酸(EDTA)至终浓度10mmol/L，通过螯合内切酶的辅助因子Mg2+而终止反应； （2）加SDS：加入十二烷基磺酸钠(SDS)至终浓度为0.1%(w/v)，使酶变性而终止反应。,2019/4/12,48,酶解后仍需进行下一步反应(如连接或酶切反应等) ： （3）加热：可将酶解液于65水浴中保温20min。通过加热使酶失活，但这种方法只适合于大多数最适反应温度为37 的限制性核酸内切酶，对有些最适反应温度较

24、高的酶不能使之完全失活。 （4）其它 ：即DNA纯化方法。如用酚氯仿抽提，然后乙醇沉淀，此法最为有效而且有利于下一步DNA的酶学操作。,2019/4/12,49,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATG,3 CGATGTACCTAG,5 GCTACATGGATCCC,3 CGATGTACCTAGGG,5.4 多酶联合酶解策略,GATCCCGGGTTCGCAT3,GGCCCAAGCGTA5,CCCAAGCGTA5,GGGTTCGCAT3,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,BamHI S

25、maI,2019/4/12,50,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,2.5倍体积的冰冷乙醇，0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4，冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,5.4 多酶联合酶解策略,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,51,5.5 DNA分子酶切常用缓冲液,http:/ 限制性核酸内切酶,52,DNA分子酶切缓冲液的选择,http:/ 限制性核酸内切酶,53,Double Digestion (双酶切反应) 时的Univers

26、al Buffer (通用缓冲液) 的使用表,http:/ 限制性核酸内切酶,54,5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解,如果一种限制性核酸内切酶对DNA分子上所有识别的位点能够全部酶解，切割反应达到了这样的片段化水平，我们称之为完全的酶切消化作用。,2019/4/12,55,然而,实际上有时限制性核酸内切酶对DNA分子的完全酶切消化作用是达不到的，称不完全的酶切消化作用。这类不完全的酶切消化反应，可以获得平均分子质量大小有所增加的酶解片段。这对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。在实验中，进行局部酶解的方法有减少酶量，增加反应体积，缩短反应时间和降低反应温度等。,2019/4/12,第

27、节 限制性核酸内切酶,56,5.7 内切酶酶解反应中的注意事项,（1）大多数厂家供应的内切酶为浓缩液；通常1u的酶液足以在lh内消化10ug DNA。当需要消化的底物量较小，只需少量酶液时，可用一次性栘液器吸头轻轻接触液面，这样取出的酶约为0.1 ul。 （2）浓缩的酶液可用1 x限制酶缓冲液稀释(不能用水稀释，以免酶变性)，稀释的酶液不能保存过长时间，要尽快用完。 （3）内切酶在含50甘油的缓冲液中，于-20稳定保存。一般总是在其他试剂加完后再加入限制性核酸内切酶。将酶取出后，应置于冰中，每次取酶必须使用新的无菌吸头。应尽快操作，尽可能缩短酶在冰箱外放置的时间，用完后立即放回。,2019/4

28、/12,57,（4）限制性核酸内切酶应分装成小份，避免反复冻融。 （5）反应中尽可能少加水，使反应体积减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的1/10。否则酶液中的甘油会限制酶的活性。 （6）通常延长反应时间，可使所需的酶量减少。当切割大量DNA时，这样做比较节约； （7）当用同一种酶切割多个DNA样品时，可先计算出所需酶的总量(考虑到转移过程中的损失，实际使用的酶量比计算数值梢过量)，然后取出酶并用相应的1x缓冲液稀释，再将酶稀释液分别加入不同的DNA样品中。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,58,第一节 限制性核酸内切酶,1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型

29、3、限制性核酸内切酶的命名 4、型限制性核酸内切酶的基本特性 5、型限制性核酸内切酶的酶切反应 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,59,6、影响限制性核酸内切酶活性的因素,6.1 DNA的纯度 DNA提取过程中的杂质。如：蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 措施： 纯化DNA； 加大酶的用量（ 平均每ug底物酶20）； 延长酶作用时间（保温时间）； 扩大反应体积（ 20l），使潜在的抑制因素被相应的稀释。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,60,6.2 DNA的甲基化程度,大肠杆菌一般有两种甲基化酶：,dam甲基

30、化酶：在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基。dcm甲基化酶：在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基。,措施： 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA防止DNA的甲基化。 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,2019/4/12,61,6.3 酶切消化反应温度,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数为37，一部分为50-65，少数25-30。高温作用酶，在37时，活性多数为10-50%。,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,62,6.4 缓冲液(Buffer),商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液 缓冲液的化学组成,MgCl2、NaCl/KC

31、l: 提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl： 维持pH （7.07.6 ）；二硫苏糖醇(DTT)或-巯基乙醇 保持酶的稳定性，防止氧化；牛血清白蛋白BSA等： 有助于酶的稳定,可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性,2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,63,不同的酶对离子强度要求不同，据此缓冲液分为三种：,低盐缓冲液L (10mmol/LNaCl); 中盐缓冲液M (50mmol/LNaCl); 高盐缓冲液H (100mmol/LNaCl ),2019/4/12,第节 限制性核酸内切酶,64,6.5 DNA分子的构型,不同构型DNA分子在进行限制性酶切反应时条件不同，酶解所需要的酶量，例

32、如，超螺旋质粒DNA或病毒DNA比线性DNA酶解所需要的酶量高许多，甚至可高达20倍。 另外有些限制性核酸内切酶对于同一DNA分子上不同位置的识别序列切割效率明显不同。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差异造成的。大体说来，一种RE对其不同识别位点切割速率的差别最多不会超过10倍。,第节 限制性核酸内切酶,65,6.6 反应时间,限制性内切酶反应时间通常为1h，但大多数酶活性可维持很长的时间，进行大量的DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。,2019/4/12,66,6.7 酶量使用,不同的酶酶量使用有差异少数RE，使用酶量少，如：Ase 0.3 U可满足1g pBR322切割多数RE，

33、使用酶量多，如酶切pUC19Ava 10 U Nar 20 USca 15 U Eag 10 U,2019/4/12,67,第二节 DNA连接酶,1、DNA连接酶的发现 2、DNA连接酶的概念及其特点 3、DNA连接酶的种类 4、DNA连接酶的反应体系 5、影响连接反应的因素 6 、DNA片段连接的策略,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,68,1、DNA连接酶的发现,环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种Nick的酶存在。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条 DNA链之间形成磷酸二酯键的酶DNA连接酶（ligase）。,2019/4/12,69,2

34、、概念及其特点,2.1 概念：指能封闭DNA链上缺口的一种酶。 2.2 DNA连接酶的特点： A. 连接的两条链必须分别在3端具有自由羟基（-OH）和5端具有磷酸基团（-P），且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应； B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键，该反应是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即由ATP或NAD+提供能量。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,70,C 只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,71,3、DNA连接酶的种类,已

35、发现的DNA连接酶主要有以下3类： T4噬菌体DNA连接酶； 大肠杆菌DNA连接酶； T4噬菌体RNA连接酶。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,72,3.1 T4噬菌体DNA的连接酶,T4噬菌体DNA的连接酶简称T4DNA连接酶，分子质量为68Da，需要ATP作为辅助因子，最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，其编码基因已被克隆，并可在大肠杆菌中大量表达。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,73,T4噬菌体DNA连接酶可以催化的连接反应 两个带有互补黏性末端的双链DNA分子； 两个带有平末端的双链DNA分子； 一条或两条链带有缺口的双链DNA分子； RNA 、DNA杂合体

36、中RNA链上的缺口。,两个带有平末端的双链DNA分子,一条或两条链带有 缺口的双链DNA分子,修复与RNA结合的DNA链上的缺口形成磷酸二酯键,两个完全断开的平头末端DNA分子在该酶作用下连接速度非常缓慢。主要原因是T4DNA连接酶对于平头末端Km比黏性末端的Km高约1000倍。因此在进行平头末端DNA分子连接时，可采取以下措施来提高连接效率： 加入更多的T4DNA连接酶； 保证较高的底物浓度； 加入适量的一价阳离子和低浓度的PEG，可提高连接酶对平头末端的连接活性； 提高ATP浓度。ATP浓度对酶的活性影响很大，一般最适终浓度为0.5mmol/L。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,

37、74,由于T4噬菌体连接酶可连接的底物范围广，尤其是能对DNA分子的平头末端进行较好的连接，因此在DNA体外重组技术中广泛应用。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,75,3.2 大肠杆菌DNA连接酶,大肠杆菌DNA连接酶分子质量为75Da，需要NAD+作辅助因子，该酶基因已经克隆并在大肠杆菌中大量表达。 大肠杆菌DNA连接酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接，它的适合底物是： 一条链带缺口的双链DNA分子 具有同源互补黏性末瑞的不同DNA片段。 由于大肠杆菌DNA连接酶对DNA末端要求比较严格(互补的黏性末端)，所以它的连接产物转化细菌后，假阳性背景非常低，这是大肠杆菌DNA连接

38、酶较T4噬菌体DNA连接酶的一个优点。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,76,3.3 T4噬菌体RNA连接酶,T4噬菌体RNA连接酶需要ATP作辅助因子，催化单链DNA或RNA的5磷酸基与相邻的3羟基共价连接。此酶的主要用途是对RNA进行3末端标记，也就是将32P标记的3,5二磷酸单核苷加到RNA的3端。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,77,4、DNA连接酶的反应体系,4.1 T4噬菌体DNA连接酶的活性单位 T4噬菌体DNA连接酶的活性单位有多种定义，较通用的是韦氏（weiss）单位。1个韦氏单位是指在37， 20min内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到,-p32A

39、TP所需要的酶量。 使用不同方法测定T4噬菌体DNA连接酶的催化活性，可有不同的酶活性定义。在使用时一定要了解厂商所使用的单位。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,78,4.2 DNA连接酶的反应体系 被连接的DNA片段的末端结构不同， DNA连接酶的反应条件也有所不同。一个较普遍的反应体系(50ul) 如下： 5ul 10 x T4噬菌体DNA连接酶缓冲液； 1weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶； 0.51.0mmol/LATP； 1.0ugDNA(0.11.0umol/L 5末端)； 反应终体积为50ul。 根据DNA片段的分子大小及末端结构，在430下反应116h。,2019

40、/4/12,第二节 DNA连接酶,79,对于黏性末端一般在416之间进行反应，以保证黏性末端退火及酶活性、反应速率之间的平衡。 平头末端连接反应可在室温(30)进行，并且需用比黏性末端连接大10 100倍的酶量。 终止反应可加入2ul 0.5mol/L的EDTA或者75水浴10min。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,80,5、影响连接反应的因素,DNA片段的连接过程与许多因素有关如： 反应温度； 连接酶的浓度； ATP浓度； DNA片段末端浓度。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,81,5.1 反应温度,温度是影响连接反应的主要因素。连接酶的最佳反应温度为37。 黏性末端连

41、接反应温度 如连接温度介于同源黏性末端的Tm值与酶的最佳反应温度（37）之间，可以保证黏性末端迟火及酶活性、反应速率之间的平衡，所以一般在416之间进行反应， 黏性末端G+C含量高，其连接反应温度也可提高。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,82,平头末端连接反应温度 与黏性末端的连接反应相比，平头末端连接反应受温度的影响较小。因为平头末端连接不需要考虑两个末端的退火问题，所以连接反应的最适温度原则上近似于反应中最小片段的Tm，一般为1020，但温度过高(30)会导致T4噬菌体DNA连接酶的不稳定。,2019/4/12,83,5.2 连接酶的浓度,在平末端DNA分子的连接反应中，最适的

42、反应酶量大约是12个Weiss单位。 对于黏性末端DNA分子间的连接，在同样的条件下，酶浓度仅为0.1个Weiss单位，便能得到较高的连接效率。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,84,5.3 ATP浓度,ATP作为T4噬菌体连接酶的辅助因子，其浓度对酶的影响很大。 一般情况下，ATP最适的终浓度为0.5mM，当ATP浓度上升至5.0mM时，将影响酶对平头末端的连接；若ATP为7.5 mM时，对黏性末端及平头末端的连接均有抑制作用。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,85,5.4 DNA片段末端的浓度,两个DNA末端之间的连接可认为是双分子反应，在标准反应条件下，其反应速度完全

43、由互相匹配的DNA末端浓度所决定。同时，重组子的DNA分子构型与DNA浓度及其分子长度存在密切关系。在连接反应体系中，由于DNA末端之间的相互竞争，一般可形成两种不同构型的DNA分子： 线性分子； 环状分子。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,86,5.4.1 线性分子,不同DNA片段的两个末端首尾相连而成。 在一定浓度下，小分子DNA片段进行分子内连接，有利于形成环化分子，因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的概率。 对于长度一定的DNA分子，其浓度降低有利于分子环化。如果DNA浓度增加，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另

44、一个DNA分子末端的可能性也有所增大。因此,较高浓度的DNA，有利于分子间的连接，形成线型二聚体分子或多聚体分子。,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,87,5.4.2 环状分子,由线性分子的两端进一步连接形成。 对于两个以上的DNA分子的连接，如载体DNA与外源插入片段，要使它们连接形成重组体，不仅要考虑反应体系中DNA末端的总浓度，而且还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。 原则上，应该保证一个DNA分子的末端具有较高的几率与另一个DNA分子连接，这样才能减少同一个分子两个末端之间的自身连接，从而达到重组的目的DNA分子间的连接，形成环化二聚体分子。,2019/4/12,第二节 D

45、NA连接酶,88,6 DNA连接的策略,6.1 粘性末端DNA片段的连接,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,89,6.2 平末端DNA片段的末端连接法,6.2.1 常规连接 6.2.2 加衔接物连接法 6.2.3 末端加尾连接法,2019/4/12,第二节 DNA连接酶,90,6.2.1 常规连接,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）; 加大底物的浓度，增加分子间碰撞机会; 加入10% PEG8000，促进分子间的有效作用; 加入单价阳离子（NaCl,最终浓度150-200mM ）。,2019/4/12,91,6.2.2 加衔接物连接法,衔接物(linker)：也叫接头，是有人工

46、化学合成的一段1012个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。,2019/4/12,92,6.2.3 末端加尾连接法,即同聚物加尾连接：就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要核酸外切酶、S1核酶、末端转

47、移酶等协同作用,2019/4/12,93,6.3 防止自连-载体去磷酸化,2019/4/12,94,第三节 DNA聚合酶,1、大肠杆菌DNA聚合酶 2、Klenow片段 3、T4噬菌体DNA聚合酶 4、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶 5、Taq DNA聚合酶 6、逆转录酶,2019/4/12,第三节 DNA聚合酶,95,概 述,DNA聚合酶(DNA polymerase)能在引物和模扳的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。合成方向对应于被合成链而言是从5端到3端。并且合成的产物与模板互补。根据DNA聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类： 依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow大片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶等； 依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。,