1、主讲人：沈晓君,第三节 仪器分析法,有机药物分子中含有共轭结构，生、助色基团而显示特征吸收光谱，可作为鉴别的依据。 光谱简单，专属性差。,1.紫外光谱鉴别法,紫外-可见光区的波长范围,200400nm,紫外光谱的特征,吸收峰,吸收峰,谷 ,谷 ,末端吸收,常用的方法有： 对比法：测定供试品的吸收光谱或规定的信息参数对比；或与对照光谱及特征参数对比； 测定最大吸收波长，或同时测定最小吸收波长； 规定一定浓度的供试液在最大吸收波长处的吸收度； 规定吸收波长的吸收系数法； 规定吸收波长的吸收度比值法； 经化学处理后，测定其反应产物的吸收光谱特性。 以上方法可以单个应用，也可几个结合起来使用，以提高方
2、法的专属性。,测定最大吸收波长，或同时测定最小吸收波长,乙胺嘧啶 供试品在0.1mol/L的介质中的紫外吸收在272nm处为峰，216nm处为谷。,规定吸收波长的吸收度比值法,两性霉素在362nm、381nm、405nm波长处有最大吸收，规定：362nm/381nm吸光度比值不大于0.6381nm/405nm吸光度比值不大于0.9VB12 361nm/278nm 1.701.88361nm/550nm 3.153.45,安宫黄体酮(M=386.53),炔诺酮(M=298.43),max=2401nm,max=2401nm,3,3,4,4,规定吸收波长和吸收系数法,三种甾体激素的紫外吸收光谱 (
3、10g/ml甲醇溶液）,醋酸泼尼松,醋酸氢化可的松,醋酸可的松,与对照品比较，对比吸收光谱的一致性,紫外-可见分光光度计的主要部件,光源：提供能量激发被测物质 单色器：将来自光源的连续光谱按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带，获得所需单色光 吸收池：盛放溶液并提供一定吸光厚度 检测器：检测光讯号，并将光讯号转变为电讯号 讯号处理及显示器：迅号放大、数学换算,专属性强、应用较广（固体、液体、气体样品）。 主要用于组分单一、结构明确的原料药，特别适合于结构复杂、细微差别同类药物，如磺胺类、甾体激素类和抗生素类药品。,2.红外光谱法,鉴别方法：中国药典和BP(2000）均采用标准图谱对照法。
4、首先测定供试品IR图谱，然后与标准的对照图谱比较。Ch.P.制订有与其配套的药品红外光谱集。,（1）试样制备方法,压片法,供试品（约1mg）+干燥KBr/KCl（约200mg）,研磨均匀（玛瑙研钵）,置模具中 加压0.8-1Gpa,均匀透明片 无明显颗粒 供试片,2-5min,同法制空白KBr/KCl片，做空白校正，扣除背景干扰,糊法,供试品（约5mg），滴加少量液体石蜡或其他液体,玛瑙研钵,制成糊状物,取适量 夹于两KBr片（150mg/片）之间,供试片,KBr片（约300mg），制成空白片，做背景校正,膜法,供试品多为高分子聚合物，可做成液膜铺展于适宜盐片上,溶液法,液体供试品（或溶于适宜
5、的溶剂内），制成1%-10%的溶液，至于0.1-0.5厚的液体池中，即可测的,（2）应用光谱图对照时应注意的问题：1）由于晶型的影响，致使录制的光谱图与光谱集所收载的光谱图不一致，应按光谱集中各相应光谱图中备注的方法进行预处理后，再行录制。 分别按同晶型对照的图谱比较同质异晶现象的药品。,2）采用压片法时，若样品（包括盐酸盐）与溴化钾之间不发生离子交换反应，则采用溴化钾作为制片基质。否则，盐酸盐样品制片时必须使用氯化钾基质。 3）测定时应注意二氧化碳和水汽（3440cm-1及1630cm-1）等的大气干扰，必要时，应采取适当措施（如采用干燥氮气吹扫，真空）加以改善。,4）仪器间分辨率的差异及不
6、同的操作条件（如狭缝程序，扫描速度等）可能影响药品光谱图的判断。 需用在比较样品的光谱图前，首先比较聚苯乙烯薄膜的光谱图。 5）本法对于多组分药物或存在多晶现象而又无可重复转晶方法的药物不适用。,色谱鉴别法,利用不同物质在不同色谱条件下，产生各自的特征色谱行为（Rf值或保留时间）进行鉴别试验。采用与对照品（或经确证的已知药品）在相同的条件下进行色谱分离，并进行比较鉴别。常用的方法有：,1.薄层色谱法 一般采用对照品（或标准品）比较法，要求供试品与对照品主斑点的颜色与位置应一致。,2.高效液相色谱和气相色谱法 一般规定按供试品含量测定项下的色谱条件进行试验。要求供试品和对照品色谱峰的保留时间应一
7、致。 内标法时，要求药物与内标物峰的保留时间比值也应相同。,液相色谱仪,HPLC流程及主要部件,1.流程,2.主要部件,(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(2)梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3) 进样装
8、置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,(4) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5) 液相色谱检测器,a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,b.荧光检测器,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性
9、、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。,常用溶剂的极性顺序：水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷
10、煤油(最小),水、甲醇、氯仿、正丁醇极性大小？,选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。溶剂需脱气，过滤。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,气相色谱法,气相色谱法是采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。,注入进样口的供试品被加热气化，并被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后
11、进入检测器，色谱信号用记录仪、积分仪或数据处理系统纪录。,工作流程示图,1.载气瓶 2.压力调节器 3.净化器 4.稳压阀 5.柱前压力表 6.转子流量计 7.进样器 8.色谱柱 9.色谱柱恒温箱 10.馏分收集口(柱后分离阀) 11.检测器 12.检测器恒温箱 13.记录器 14.尾气出口,1.仪器分析应用数量增加，尤其是红外光谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。 2.制剂广泛采用IR法鉴别。与原料药相比，制剂需先分离再压片绘制图谱。,二、药物鉴别方法新动向,鉴别试验必须在规定条件下完成，否则将会影响结果的判断。影响鉴别反应的主要因素有被测物浓度，试剂的用量，溶液的温度、 pH ，反应时间和干
12、扰物质的存在等。,三、鉴别试验条件,（一）反应灵敏度和空白试验 在一定条件下，能在尽可能稀的溶液中观测出尽可能少量的供试品，反应对这一要求所能满足的程度，即称为反应的灵敏度（sensitivity）。它以两个相互有关的量来表示：,四、鉴别试验灵敏度,最低检出量（又称检出限量） （以m表示），就是应用某一反应，在一定的条件下，能够观测出试验结果的供试品的最小量，其单位通常用微克（g）表示。 最低检出浓度（又称界限浓度），是应用某一反应，在一定条件下，能够观测出供试品的最低浓度，通常以1: V(或1:G）表示，其中V(或G)表示含有1g重某供试品的溶液的毫升（或克）数。,影响条件： 1.在选用灵敏度很高的反应时，必须采用高纯度的试剂，非常洁净的器皿，才能保证鉴别试验结果的可靠性。 2.为了消除试剂和器皿可能带来的影响，应同时进行空白试验（blank test)以供对照。 空白试验，是在与供试品鉴别试验完全相同的条件下，除不加供试品外，其它试剂均同样加入而进行的试验。 3.与分析方法、观察方式、反应条件、人的观察能力等因素有关。,（二）提高反应灵敏度的方法,1.特定溶剂富集有色生成物，易于观测。 2.改进观测方法 客观化，科学化。3.降低仪器噪音,
