1、用玉米叶肉原生质体进行瞬时表达实验（PEG 转）一、生长条件将玉米种子浸泡过夜，然后移到蛭石和营养土各半的培养基中光照生长 3 天（地上部分大约 1cm 左右） ，再移到黑暗条件下生长直到第二片叶的长度比第一片叶长 10-15cm，这需要在 25条件下生长 10-11 天。只浇水不用施肥。为了防止细菌生长，可往培养基中加入 50-100g/ml 的 Amp。黄化叶片的原生质体可用于实验，茎和根也可以用，但尽量避免用绿色的叶片。二、原生质体分离切取第二片叶的中部（6-8cm） 。将 20 片叶叠在一起，轻压，切成 0.5mm 的条，不要损伤叶片。刀片用 95%的酒精清洗。1 克含有5106的原生
2、质体可做 50 个反应。在 250ml 的容器中放入 10-20ml 的酶液，放入切好的叶片，抽真空 30min，40rpm 轻摇，继续消化 3-4hr。通常消化时间往往在黑暗条件下延长至 16-18h。在显微镜下检测原生质体的完整性，玉米叶肉原生质体的大小为 25-35um。80rpm 继续震荡 5min，使原生质体完全释放。三、纯化1、将消化好的原生质体用 74uM 的滤网过滤到 10ml 离心管中，原生质体用枪转移，需剪掉枪头。2、4，100xg 离心 2min，吸掉上清（需剪枪头） ，将原生质体迅速轻轻弹起，然后沿离心管壁加入 W5 buffer，使原生质体悬浮（加入 buffer 的
3、量视原生质体而定，通常为 1-5ml） 。3、重复步骤 2 一次。4、4，100xg 离心 1min，吸掉上清，将原生质体迅速轻轻弹起，然后沿管壁加入 W5 buffer，使原生质体悬浮，冰上放置 30min。5、将 10ul 1ug/ul 的质粒加到干净的 2ml 离心管中。6、吸掉原生质体上方的上清，沿管壁加入 1ml MMg 悬浮原生质体。7、4 100xg 离心 1min。8、吸掉上清，再加入 MMg 重新悬浮原生质体，用量考虑原生质体的浓度，保持在 104-5个/ml。9、检测原生质体的完整性。10、往含有质粒的 2ml 离心管中加入 100ul 原生质体，混匀，再加入原生质体和质粒
4、总体积的 PEG，混匀。11、放入适宜的培养温度中转化 1-1.5hr。12、再加入 2 倍体积的 W5 buffer（常温） ，上下轻轻晃动混匀。13、常温，100xg 离心 1min。14、吸掉上清，加入 500ul W5 buffer（常温）悬浮。15、常温，100xg 离心 1min。16、往细胞培养板中加入 1ml W5 buffer。17、吸掉上清，吸取培养板中少量 W5 buffer（常温）于离心管中，将原生质体充分悬浮后转移到培养板中，转移过程中要环绕加入，使原生质体充分分散。18、检测细胞完整性。19、培养 12hr 以后检测荧光信号。四、溶液配制1、母液（20ml）10mM
5、 MES(195.24) 配成 100mM 需 MES 0.39g pH=5.71mM CaCl2（147.02） 配成 1M 需 CaCl2 2.94g20mM KCl(74.55) 配成 200mM 需 KCl 0.298g154mM NaCl（58.44） 配成 2M 需 NaCl 2.34g15mM MgCl2(203.3) 配成 50mM 需 MgCl2 0.203g2、酶液（20ml）A、玉米100mM MES 2ml 终浓度 10mM pH=5.71M CaCl2 20ul 终浓度 1mM甘露醇（182.2） 2.186g 终浓度 0.6M纤维素酶 R10 0.3g 终浓度 1.
6、5%果胶酶 R10 0.06g 终浓度 0.3%-巯基乙醇 7.8ul 终浓度 5mMBSA 0.02g 终浓度 0.1%先将 MES 和 CaCl2混合，再加入适量的水，然后加入甘露醇，待溶解后再依次加入剩余药品，完全溶解后定容，最后用 0.42uM 的过滤器过滤，4保存。3、W5 buffer（100ml）2M NaCl 7.7ml 终浓度 154mM1M CaCl2 12.5ml 终浓度 125mM200mM KCl 2.5ml 终浓度 5mM100mM MES 2ml 终浓度 2mM pH=5.7配好后 4保存。4、MMg buffer （10ml）甘露醇（182.2） 0.729g 终浓度 0.4M50mM MgCl2 3ml 终浓度 15mM100mM MES 0.4ml 终浓度 4mM pH=5.7配好后-20保存。5、PEG/Ca 2+ buffer （10ml）(先加 CaCl2和甘露醇，用水溶了之后再加 PEG，再定容)1M CaCl2 1ml 终浓度 0.1M甘露醇（182.2） 0.364g 终浓度 0.2MPEG-4000 4g
