1、实验三、饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析外标法定量一、实验目的1 进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。2 巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。3 掌握外标法定量及 Origin 软件绘制标准曲线。二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为 1，3，7三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。咖啡因在咖啡中的含量约为 1.21.8，在茶叶中约为 2.04.7。可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。咖啡因的分子式为 C8H10O2N4，结构式为： NNNNOOCH3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的
2、极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。本实验采用反相液相色谱法，以 C18 键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。三、实验仪器和试剂1. Agilent 1100 和 Agilent 1200 高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR） ，超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液 配制含咖啡因 1000 ug/mL 的甲
3、醇溶液，备用。（2）标准系列溶液 用上述贮备液配置含咖啡因 20 ug/mL，40 ug/mL，80 ug/mL，160 ug/mL，320 ug/mL 的甲醇溶液，备用。4. 试样 市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件1. 色谱柱（XDB-C 18） 颗粒度为 5 um 的固定相，长 150 mm 内径 4.6 mm2. 流动相 甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 1 mL/min3. 检测器 紫外光度检测器，270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1. 将流动相甲醇和水分别过滤后于超声波发生器上脱气 15 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气 15 m
4、in.3. 接通仪器和电脑电源，打开计算机，自动出现并运行 Bootp Server 程序（1200 LC 没有出现此界面） 。4. 从上到下依次打开 LC 各模块电源。5. 待各模块自检完成后，Bootp Server 窗口显示 6 行仪器与计算机连接正常的信号后， （注意：Bootp Server 程序窗口不能关） ，双击电脑桌面上的 Instrument 1 Online 图标，化学工作站自动与 LC 通讯，进入工作站画面。6. 单击工作站画面的 On 按钮，系统 Pump 打开，并根据上次实验设定的流速和流动相开始工作（一般此时流动相是纯甲醇） 。7. 打开仪器上的 Purge val
5、ve，则系统开始 Purge，单击 Pump 图标，将流速设到 2 mL/min 直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续 Purge，直到所有要用通道无气泡为止。然后将流速设为 0.5 mL/min，再关闭 Purge valve。8. 单击 Pump 图标，进入 Pump 编辑画面，先用 0.5 mL/min 甲醇清洗仪器 30 min，待仪器液路和电路系统达到平衡时，压力稳定，基线呈平直，再设定实验所需的流速和流动相。9. 单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。 10. 点 VWD 图标，设定实验所需波长。11. 待设定参数后的仪器液路和电路系统达到平衡时，压力稳
6、定，基线呈平直，将仪器调节至进样状态（Load 位置） ，依次分别用专用的平头针头吸取 10 uL 的五个标准溶液和待测定的可口可乐和百事可乐进样并把进样阀扳到 Inject 位置。 （每次进样前可在“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，输入操作者名称等信息，在“Data file ”中选择Prefix，并在 Prefix 框中输入前缀，在 Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如 vwd0001，vwd0002） ，12. 分析结束后，从 Run control 菜单中选择最后一项，即停止进样分析，此时仪器自动记录并积分色谱图。13. 打印色
7、谱图。14. 待所有样品分析完后，单击 Pump 图标，进入 Pump 编辑画面，准备清洗仪器，本实验用 0.5 mL/min 的甲醇清洗仪器 30 min，若实验过程用到酸或缓冲盐做流动相，须先用0.5 mL/min 水清洗仪器 60 min，再用 0.5 mL/min 的甲醇清洗仪器 30 min。15. 当仪器冲洗干净后，单击工作站画面的 Off 按钮，关泵，退出化学工作站，关掉 Bootp Server 窗口，关闭计算机（用 shut down 关） ，最后从下往上关掉 LC 电源开关。再关总电源。16. 实验结束后做好仪器使用情况登记，经实验指导老师签名后方可离开实验室。六、实验数据及处理1. 处理色谱数据，将标准溶液及试样中咖啡因的保留时间及峰面积列于表中。保留时间 tR/min 峰面积 A/mVs标准溶液 20 ug/mL标准溶液 40 ug/mL标准溶液 80 ug/mL标准溶液 160 ug/mL标准溶液 320 ug/mL可口可乐百事可乐2. 用 Origin 软件绘制咖啡因峰面积质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。3. 根据试样溶液中咖啡因的峰面积值，计算可口可乐和百事可乐中咖啡因的质量浓度。七、思考题用标准曲线法定量的优缺点是什么？
