1、第三部分 实验内容实验一 细菌芽孢、荚膜、鞭毛的染色及形态观察一、目的要求1、学习掌握细菌制片的操作技 术和无菌操作技术。2、学习掌握细菌芽孢、鞭毛、荚膜的染色方法。二、实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。1. 鞭毛是细菌的运动“器官，细菌是否具有鞭毛，以
2、及鞭毛者生的位里和数目是细茵的一项重要形态特征。细菌的椒毛很纤细，其直径通常为 0 . 010.02 um ，所以，除了很少数能形成毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观寮细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍鞭毛染色法和改良的 Uifson 氏染色法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。2.细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染
3、色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。3. 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易染色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法染色（负染色法） ，使菌休和背景着色，而荚
4、膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。三、实验器材1、菌种：苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum） 斜面菌种。2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、载玻片、盖玻片、试管、细玻棒、水浴锅。3、牛肉膏蛋白胨培养基、鞭毛染色液、 0.5沙黄水溶液、绘图墨水、 95乙醇、石炭酸复红染液、5%孔雀绿溶液、 0.5%番红色液、蒸馏水、双料瓶（香柏油和二甲苯）。四、方法步骤1. 细菌鞭毛染色
5、步骤：（l）菌种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种 12 次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a 取新配制的营养琼脂斜面（表面较湿润、基部有冷凝水）接种，28 32 培养 1014h ，取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察材料；b 选取新制备的营养琼脂（含 0.81 . 0 的琼脂）平板，用接种环将新鲜菌种点种于平板中央，2832 培养 18 30h ，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔（不要取菌落中央的菌谷）作染色观察的菌种材料。（2）载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约 20 min ，取出用清水充分洗净，沥干水后置 95
6、乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。（3）菌液的制备。取斜面或平板菌种培养物数环于盛有 12 环无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片, 也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。挑菌时，尽可能不带培养基。（4）制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，便菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温或 37 温室）自然千燥。干后应尽快染色不宜放，时间过长。（5）染色涂片干燥后，滴加鞭毛染色 A 液顶盖 35 min ，用熏馏水充分洗去 A 液用 B 液冲去残水后，再加 B 液夜盖涂片染色约数秒至 l min ，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，若加
7、 B 液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗，自然干燥。（6）镜检干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。2. 细菌芽孢染色步骤：A.改良的 Schaeffer-Fulton 氏染色法（l）制备菌悬液：加 1-2 滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 2-3 环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。（2）加染色液：加 5%孔雀绿水溶液 2-3 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。（3）加热：将此试管浸于沸水浴的烧杯中，加热 15-20min。（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌
8、液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰 3 次固定。（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。（7）复染：加番红染液染色 2-3min 后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。B.Schaeffer-Fulton 氏染色法（l）涂片：按常规方法将待检细菌制成涂片。（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过 2-3 次固定。（3）染色：加数滴 5%孔雀绿染液于涂片处，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染液冒蒸汽并开始计算时间，维持 5min。加热过程中要随时添加染色液
9、，切勿让标本干涸。待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。用番红染液复染 2min。（4）水洗：用缓水流洗后，吸干。（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。3. 细菌荚膜染色步骤：A. 干墨水法（l） 制混合液:加一滴 6葡萄塘液于洁净载玻片的一端，然后挑取少量 菌体与其很合，再加一环墨水，充分混匀玻片必须洁净无油迹否侧，涂片时混合液不能均匀散开（2） 涂片:另取一端边缘光滑的载玻片作推片，将推片一端的边缘里于混合液前方，然后稍向后拉，当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，尔后以大约 300o 角
10、迅速将混合液推向玻片另一端，使混合液铺成薄层.（3） 干燥:空气中自然千燥（4） 固定:用甲醇浸没涂片固定一分钟倾去甲醇（5） 干燥:在酒精灯上方用文火干燥（6） 染色:用甲基紫染 12min （7） 水洗:用自来水轻轻冲洗，自然干燥（8） 镜检:用低倍和高倍镜观察背景灰色菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜B. Anthony 氏法（1）涂片:按常规取菌涂片。（2）固定:空气中自然干燥。不可加热干燥固定。（3）染色:用 l的结晶紫水溶液染色 2 min（4）脱色:以 20的硫酸铜水溶液冲洗用吸水纸吸干残液（5）镜检:干后用油镜观察菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。实验报告：1 绘出所用
11、材料的芽胞、鞭毛、荚膜和菌体的形态图。2说明芽胞染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽 孢？3用 Schaeffer-Fulton 氏染色法加热染色时，若因一 时疏忽玻片上的染液被烘干，此时是否立即补加染液？为什么？4若涂片上所观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽 孢 囊及营养细胞，你 认为这是什么原因？实验二 酵母菌形态结构的观察实验目的：1观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 实验原理：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细 菌大几倍甚至十几倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通 过接合产生子囊孢子。本
12、实验通过美蓝染液水侵片来观察酵母菌的形态和发芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色， 还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细 胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死 细胞和活细胞进行鉴别。实验器材：1.菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约 2day 的麦芽汁斜面培养物。2.溶液或试剂 0.05%和 0.1%吕氏碱性美蓝染色液，革 兰氏染色用碘液。3.仪器或其它用具 显微镜、载玻片
13、、盖玻片、无菌吸管、平皿。实验内容：（一）酵母观察1.美蓝浸片的观察(1) 在载玻片中央加一滴 0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀。(2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢地将盖玻片放下使其盖在菌液上。 (3) 将制片放置约 3min 后镜检，先用低倍 镜后用高倍镜观 察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。(4) 染色约 0.5h 后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。(5) 用 0.05%吕 氏碱性美蓝染液重复上述操作。2.水碘液浸片的观察在载玻片中央加一小滴革兰氏染色液用碘液，然后在其上加 3 小滴水，取少 许酵
14、母菌苔放在水碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检 。实验报告：1绘图说明你所观察到的酵母菌的形 态特征2说明观察到的吕氏碱性美蓝 染液浓度和作用时间不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？分析其原因。3在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区 别于一般细菌？4在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？实验三 放线菌和霉菌形态的观察实验目的： 掌握观察放线菌形态的基本方法，并 观察放线菌的形态特征。实验原理：放线菌是指能形成分枝丝状体或者菌丝体的一类革兰氏阳性菌,常见的放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称基丝), 基丝长到一定程度还能向空气中生长出气生菌丝(简称
15、气丝),并进一步分化产生孢子丝以及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据观察放线菌的形态特征常用扦片法、玻璃纸法、印片法。霉菌可产生分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，可用低倍显微镜观察。观察霉菌的形态主要有三种方法，A 直接制片观察法：是将培养物放置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检，其制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保存较长时间；能防
16、止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树脂封固，制成永久标本长期保存。B 载玻片培养观察法：用无菌操作将培养物琼脂薄层放置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这中方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育时期的培养物。C 玻璃纸培养观察法：霉菌的玻璃纸培养观察方法与放线菌玻璃纸培养观察方法相似。这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。实验器材：1.菌种 细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）或青色链霉菌（Streptomyces
17、glaucus），弗氏链霉菌（S. glaucus），曲霉 (Aspergillus sp.) ，青霉 (Pencillium sp.)，根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养 2-5 天的马铃薯琼脂平板培养物。2.溶液或试剂 高氏号琼脂培养基、 ，乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%乙醇、20% 的甘油等。3.仪器或其他用具 灭菌的平皿、玻璃管、盖玻片、玻璃棒、载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜、U 型玻璃棒、解剖针。实验内容：（一）放线菌观察1. 放线菌自然生长状态的观察(1) 将灭菌后的高氏 1 号培养基倒入培养皿，每皿倒 15mL 左右，凝固后备用。(2) 用经火焰
18、灭过菌的小镊子将灭菌过的优质玻璃纸平铺在平皿培养基上，如果琼脂培养基和玻璃纸之间有气泡，可以用灭过菌的玻璃棒将气泡除去。(3) 将 35mL 无菌水倒入链霉菌的斜面培养物里，制成菌悬液，再适当稀释。(4) 用无菌吸管取 0.1mL 的孢子悬液稀释液，接种在玻璃纸上，并用无菌玻璃棒涂匀后，置 28培养，直到菌长好，备用。(5) 在洁净的载玻片上滴一小滴水，稍涂布。取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取小片长有菌的玻璃纸，菌面朝上放在载玻片的水面上，使纸平贴在载玻片上。(6) 将载玻片置显微镜下观察。附：玻璃纸灭菌方法 在玻璃纸灭菌时，若直接将干燥的玻璃纸灭菌，它会缩小，发
19、皱，不便使用。故需作如下处理：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片，用水浸泡后把湿滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。2. 营养菌丝的观察(1)用接种铲连同培养基挑取细黄链霉菌菌苔置载玻片中央。(2) 用另一载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片，干燥，固定。(3) 用吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染液染 0.5-1min，水洗。(4) 干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。3. 气生菌丝与营养菌丝的比较观察。(1) 将高氏号培养基倒入无菌培养皿，制成 4mm 左右的培养基平板，经培养后无菌，备用。(2) 用火焰灭菌的镊子将无菌盖玻片以 45o 倾斜角插入
20、平皿培养基琼脂内，然后将细黄链霉菌的孢子悬液（浓度以稀释 10-210 -3 为好） ，接种在盖玻片与平皿培养基的界面上。(3) 倒置于 28培养 45 天后，小心的将盖玻片取出，把有菌的一面朝上，放在载玻片上，置显微镜下进行观察。一般情况是气生菌丝颜色较深，并比营养菌丝粗二倍左右。4. 孢子丝及孢子的观察(1) 将培养 34 天的细黄链霉菌的培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察气生菌丝和孢子丝的形态，注意分枝情况、卷曲情况等。(2) 取清洁的盖玻片一块，在菌落上面轻轻的按压一下，然后将印有痕迹的一面朝下放在有一滴吕氏碱性美蓝染液的载玻片上，将孢子等印浸在染液中，制成印片。用
21、油镜观察孢子的形态，孢子丝等。(3) 用小刀切取细黄链霉菌培养物一块（带培养基切下） 。菌面朝上放在一载玻片上，另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢子）印在后一块载玻片的中央，注意不要使培养物在玻片上滑动，否则印痕模糊不清。将制好的印片通过火焰 2-3 次固定，用石炭酸复红染色 1min，水洗，晾干。用油镜观察孢子丝的形态及孢子排列情况。（二）霉菌观察1.直接制片观察法在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于 50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染色液中，用解剖针小心地将菌丝分散开
22、。盖上盖玻片，放置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。2.载玻片培养观察法(1)培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略少于皿底的圆滤纸片，再放一 U 型玻璃棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖。包扎后 121C 灭菌 30min，烘干备用。(2)琼脂块的制作：取已经灭菌的马铃薯琼脂培养基 67mL 注入另一个灭菌平皿中，使之凝固成薄层。解剖刀切成 0.51cm 2 的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上。(3)接种：用尖细的接种针挑取很少量的孢子接种于琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖再琼脂块上。(4)培养：先在平皿的滤纸上加 35mL 灭菌的 20%甘油(用于保持平皿内的湿度)，2
23、8C 培养。(5)镜检：根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。实验报告：1在高倍镜或油镜下如何区分放 线菌的基内菌丝和气生菌 丝?2玻璃纸培养和观察法是否还 可用于其他类型微生物的培养和 观察?为什么?3. 绘图说明你观察到的放线菌的主要形态特征。4. 霉菌与放线菌形态区别。实验四 酸 奶 中 微 生 物 及 双 歧 杆 菌 口 服 液 中 微 生 物 形 态 观 察实验目的1.考察学生对微生物显微技术实验设计及实验操作程度2.激发学生创造性学习能力实验背景资料1、乳酸菌: G+，杆菌或球菌，无芽孢，微须氧或厌氧，能发酵乳糖成乳酸。 2、乳酸菌的种类旧菌名 新
24、菌名嗜温型乳脂链球菌 乳酸乳球菌乳脂亚种 乳酸链球菌 乳酸乳球菌乳酸亚种柠檬明串珠菌 肠膜明串珠菌乳脂亚种 丁二酮链球菌 乳酸链球菌丁二酮亚种 乳酸明串珠菌嗜热型嗜热链球菌 唾液链球菌嗜热亚种保加利亚乳杆菌 德氏乳杆菌保加利亚亚种乳酸乳杆菌 德氏乳杆菌乳酸亚种瑞士乳杆菌嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus1.属性嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中，释放乳酸，乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，但是益菌作用比较弱。2.保健作用调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖。嗜酸乳杆菌对致病微生物具有拈抗作用。嗜酸乳杆菌能分泌抗生物素类物质(
25、嗜酸乳菌素(acidolin) 、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(1aetocidon), 对肠道致病菌产生的拮抗作用。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，简称 A)和双歧乳杆菌 (Bifidobacterium，简称 B)混合组成的发酵剂。摄入含有这两种活菌的乳食品对消化器官有好处，特别是对胃肠功能失调的婴幼儿和一些长期口服抗菌素而引起胃肠功能失调的病人，食用含有这两种活菌的发酵乳后，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖，所以具有很好的营养保健作用.嗜热链球菌1.属性原核微生物链球菌细菌的一种链球菌 Streptococcus：兼性
26、厌氧或微好氧的革兰氏阳性菌，过氧化氢酶反应阴性，圆形或椭圆形，成对或成链状，不产芽孢，多不运动。也有少数种厌氧.2.保健作用嗜热链球菌为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌活菌真正对人体起作用的是其乳发酵产物和底物。这些物质进入人体内，可以促进体内有益菌的增殖，抑制有害菌的繁殖，起到整肠及抗菌作用.3.嗜热链球菌的形态嗜热链球菌，卵圆形，直径 0.70.9 微米，呈对或链状排列，无运动性，受培养基和培养温度影响较大。在原乳中：45 度乳中形成链状，30 度时多数菌株形成双
27、球菌。在高酸度乳中变成长链。嗜热链球菌与人类的关系密切。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。嗜热链球菌又是近年用微生物法检测牛奶中抗生素残留的首选菌种之一。干酪乳杆菌干酪乳杆菌存活的 pH 范围是 2.53.5 之间，这与人体正常的胃酸值 3.0 非常接近，可见干酪乳杆菌不但能较长时间存活于乳酸饮料中，而且能通过胃酸的考验而进入肠道的消化系统，真正起到益生的作用。并且实验证明，蛋白小肽可作为一种益生菌因子，
28、促进干酪乳杆菌在大肠内的生长实验步骤1. 完成实验设计，形成实验预习报 告2. 指导教师批阅预习报告，并就 报告内容提出参考意见3. 进行实验，记录实验结果实验总结实 验 五 发 酵 罐 内 赤 霉 菌 菌 丝 形 态 变 化 与 代 谢 关 系实验目的1.考察学生对微生物显微技术实验设计及实验操作程度2.激发学生创造性学习能力对于产赤霉素的菌丝属于液体深层培养的霉菌，但依据其代谢状态不同，菌丝形态有一定的相异性，工业上常将不同生理状态的菌丝分为 34 期。实验步骤1. 完成实验设计，形成实验预习报 告2. 指导教师批阅预习报告，并就 报告内容提出参考意见3. 进行实验，记录实验结果实验总结实
29、 验 六 环 境 中 产 纤 维 素 酶 菌 株 筛 选 及 鉴 定实验目的1. 考察学生对微生物显微技术实验设计及实验操作程度2. 激发学生创造性学习能力3. 完成实验设计，形成实验预习报 告4. 指导教师批阅预习报告，并就 报告内容提出参考意见5. 进行实验，记录实验结果6. 实验总结细菌和真菌中均有产纤维素酶的菌株，根据试验的难易程度建议做细菌，具体那些菌种产纤维素酶，可查看中国工业微生物平台，http:/www.china-cicc.org/，确定菌种后，细菌可以查阅伯杰氏手册或者中科院东秀珠老师编写的细菌鉴定手册，如果是打算做霉菌，可以查阅真菌鉴定手册，只需要稍微做下验证性试验。实验
30、步骤实验步骤1. 完成实验设计，形成实验预习报 告2. 指导教师批阅预习报告，并就 报告内容提出参考意见3. 进行实验，记录实验结果实验总结附录 染色液的配制1、吕氏（Loeffer）碱性美蓝染液A 液：美蓝（methylene blue） 0.6 克； 95%乙醇 10mlB 液：KOH 0.01 克；蒸馏水 100ml分别配制 A 液和 B 液，配好后混合即可。2、齐氏（Ziehl ）石炭酸复红 染色液A 液：碱性复红（basic fuchsin） 0.3 克；95%乙醇 10mlB 液：石炭酸 5.0 克；蒸馏水 95ml将碱性复红在研钵中岩磨后，逐渐加入 95%乙醇，继续研磨使其溶解，
31、配成 A 液。将石炭酸溶解在水中，配成。混合 A 液和 B 液即成。通常可将此混合液稀 释 5-10 倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。3、革兰氏（Gram）染色液3.1 草酸铵结晶紫染液A 液：结晶紫（crysal violet） 95%乙醇 20mlB 液：草酸 铵（ammonium oxalate） 0.8 克蒸馏水 80ml混合 A、B 二液，静置 48h 后使用。3.2 卢革氏碘液碘片 1.0 克；碘化钾 2.0 克；蒸馏水 300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。3.3 95%乙醇3.4 番红复染液番红（safranine O）
32、 2.5 克； 95%乙醇 100ml 取上述配制好的番红乙醇溶液 10ml 与 80ml 蒸馏水混匀即可。4、乳酸石炭酸棉蓝染色液石炭酸 10 克； 乳酸（比重 1.21） 10ml；甘油 20ml；蒸馏水 10ml；棉蓝（cotton blue ） 0.02 克将石炭酸在蒸馏水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解即成。5、美蓝（Levowitz Weber ）染液在 52ml95%乙醇和 44ml 四氯乙烷的三角瓶中，慢慢加入 0.6g 氯化美蓝（methylene blue chloride），旋 摇三角瓶，使其溶解。放 5-10下， 12-14h，然后加入 4ml 冰
33、醋酸。用质量好的滤纸过滤。贮存于清 洁的密闭容器中。6、 芽孢染色液（1）孔雀绿染液 孔雀绿（malachite green） 5g蒸馏水 100mL（2）番红水溶液 番红 0.5g；蒸馏水 100mL（3）苯酚品红溶液 碱性品红 11g；无水乙醇 100mL配制方法：取上述溶液 10mL 与 100mL5%的苯酚溶液混合，过滤备用。（4）黑色素（nigrosin）溶液 水溶性黑色素 10g；蒸馏水 100mL配制方法：称取 10g 黑色素溶于 100mL 蒸馏水中，置沸水浴中 30min 后，滤纸过滤两次，补充水到 100mL，加 0.5g 甲醛，备用。 7、 荚膜染色液（1）黑色素水溶液
34、黑色素 5g；蒸馏水 100mL；福尔马林（40%甲醛） 0.5mL配制方法：将黑色素在蒸馏水中煮沸 5min，然后加入福尔马林作防腐剂。（2）番红染液 与革兰氏染液中番红复染液相同。 8、 鞭毛染色液 （1）硝酸银鞭毛染色液A 液：单宁酸 5g；FeCl 3 1.5g；蒸馏水 100mL；福尔马林（15% ）2mL ；NaOH（1%）1mL冰箱内可以保存 37 天，延长保存期会产生沉淀，但用滤纸除去沉淀后，仍能使用。B 液：AgNO3 2g；蒸馏水 100mL配制方法：待 AgNO3 溶解后，取出 10mL 备用，向其余的 90mL AgNO3 中滴入NH4OH，使之成为很浓厚的 悬浮液，再
35、 继续滴加 NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的 10mL AgNO3 慢慢地滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入 AgNO3，直到 摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。冰箱内保存通常 10 天内仍可使用。如雾重， 则银盐沉淀出，不宜使用。 （2）Leifson 氏鞭毛染色液A 液：碱性复红 1.2g；95%乙醇 100mLB 液：单宁酸 3g；蒸馏水 100mLC 液：NaCl 1.5g；蒸馏水 100mL临用前将 A，B，C 液等量混合均匀后使用。三种溶液分别于室温保存可保存几周，若分别置冰箱保存，可保存数月。混合液装密封瓶内置冰箱几周仍可使用
36、。 常用培养基的配方一、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）牛肉膏 3.0g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 15-20g；水 1000ml；pH 7.0-7.2121灭 菌 20min。二、高氏（Gause ）号培养基（培养放 线菌用）可溶性淀粉 20g；KNO 3 1g；NaCl0.5g；K2HPO4 0.5g；MgSO4 0.5g；FeSO4 0.01g琼脂 20g；水 1000ml；pH 7.2-7.3配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至 1000ml。121灭菌 20min。三、马铃薯培养基（简称 PDA）（培养
37、真菌用）马铃薯 200g；蔗糖（或葡萄糖）20g；琼脂 15-20g；水 1000ml；pH 自然马铃薯去皮后，切成块煮沸 30min，然后用 纱布过滤 ，再加蔗糖及 琼脂，溶化后补足水至 1000ml。121灭菌 20min。四、完全培养基（简称 CYM）葡萄糖 20g ；蛋白胨 2.0g；酵母膏 2.0g；MgSO 4 0.5g；KH2PO4 0.46g；K2HPO4 1.0g；琼脂 15-20g；水 1000ml；pH 自然；121灭 菌 20min。五 油脂培养基蛋白胨 10g；牛肉膏 5g；NaCl 5g；香油或花生油 10g；1.6%中性红水溶液 1ml琼脂 15-20g；蒸馏水 1000ml；pH 7.2；121灭菌 20min六 合成培养基（NH4）3PO4 1g；KCl 0.2g；MgSO47H2O 0.2g； 豆芽汁 10ml；琼脂 20g；蒸馏水 1000mlpH 7.0；加 12ml 0.04%的溴甲酚紫（pH5.2-6.8，颜 色由黄变紫，作指示剂）。121灭菌20min七 明胶培养基牛肉膏蛋白胨液 100ml；明胶 12-18g；pH 7.2-7.4；在水浴锅中将上述成分熔化，不断搅拌。溶化后调 pH 7.2-7.4；121灭菌 20min八 蛋白胨水培养基蛋白胨 10gNaCl 5g蒸馏水 1000mlpH 7.6121灭 菌 20min
