1、液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3 等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为 C18 柱，其它常用的反相柱还有 C8,C4,C2 和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC 柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择1柱子的 PH 值使用范围反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的 PH 范围。一般的 C18 柱 PH 值范围都在 2-8，流动相的
2、PH 值小于 2 时，会导致键合相的水解；当 PH 值大于 7 时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相 PH 较高或经常使用缓冲液时，建议选择 PH 范围大的柱子，例如戴安公司的 Acclaim 柱 PH 2-9 或 Zorbax 的 PH 2-11. 5 的柱子。2填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基
3、封尾的色谱柱。3戴安公司 Acclaim 柱子介绍极性封尾 C16 固定相柱戴安公司有 28 种类型的柱子， Acclaim 反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。 PH 2-9 范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是 2003 年推出的 Acclaim 极性封尾 C16 柱，是最先商品化的磺酰氨-O 链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至 100%水的条件下长期使用。对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。（下图是 Acclaim 极性封尾 C16 柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）二、液相色谱柱的使用色谱柱在使用前
4、，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。1、样品的前处理a、最好使用流动相溶解样品。b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不 可逆吸附的杂质。c、使用 0.45m 的过滤膜过滤除去微粒杂质。2、流动相的配制液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长
5、时间保留在柱中)。b、流动相与样品不产生化学反应c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。3、流动相流速的选择因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为
6、 4.6mm 的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为 4.0mm 柱，流速 0.8mlmin 为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量) 。注意：a含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲 溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。b流动相要求使用 0.45 m 滤膜过滤，除去微粒杂质。c使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。 三 色谱柱的维护1. 色谱柱的平衡 反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用 1020
7、 倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。 每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的“补偿“，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡“即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30 分钟以上再用缓冲盐流动相平衡； 分析结束后必须先用纯水冲洗 30 分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗 30 分钟保护柱子。 2 色谱柱的再生长期使用的色谱柱，往往柱效会下
8、降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。 建议用来冲洗柱子的溶剂体积色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积 125-4mm 1.6ml 30ml250-4 mm 3.2ml 60ml 250-10mm 20ml 400ml 选择再生方法：极性固定相（如 Si，NH2* ，DIOL 基色谱填料）的再生：正庚烷氯仿 乙酸乙酯 丙酮乙醇水*非极性固定相（如反相色谱填料 RP18，RP8 ，CN 等）的再生： 水乙腈氯仿（或异丙醇）乙腈水注意：a. 在对 NH2 改性的色谱柱进行再生时，由于 NH2 可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用
9、0.1M 的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 b. 0.05M 稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用 0.05M 稀硫酸冲洗非常有效。3. 色谱柱的维护 a使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/ 离子性流动相中有一定的溶解度）b大多数反相色谱柱的 pH 稳定范围是 27.5，尽量不超过该色谱柱的 pH 范围c避免流动相组成及极性的剧烈变化d流动相使用前必须经脱气和过滤处理e如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中f氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及
10、连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。怎样选择色谱柱现代高效液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。一. 硅胶基质填料1正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其他具有极性官能团胺基团，如(NH2，APS)和氰基团(CN，CPS)的键合相填料。由于硅胶表面的硅轻基(SiOH)或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如:正己烷(Hexane)、氯仿(Choroform)、二氯甲烷
11、 (Methylene Cloride)等。2，反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲掖与甲醇、乙情等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H，(Phenyl)等。二聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸醋等，其主要优点是在 pH 值为 1 一 14 均可使用。相对于硅胶基质的 C18 填料，这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分
12、离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。三、其它无机填料 其它 HPLC 的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在 HPLC 流动相中不会被溶解，这类柱可在任何 PH 与温度下使用。氧化铝也可以用于 HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在 PH 高达 12 的流动相中使用。但由于氧
13、化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用 PH1-14，温度可达 100。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。怎样选择填料粒度 目前，商品化的色谱填料粒度从 1um 到超过 30um 均有销售，而目前分析分离主要用 3 和 5um 填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于 3um 的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um 填料填充柱的柱效比相同条件下的 5um 填料的柱效提高近 30%；然而，3um 的色谱柱的背压却是 5um 的 2 倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。
