1、脂质体在癌症诊疗中的载药和造影双重应用马冬 121635东南大学 生物医学与工程学院，江苏省生物材料与器件重点实验室, 江苏南京 210009摘要：脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，在其水相和脂质双分子层组成的膜内可以包裹多种物质，且具有被动靶向和主动靶向的潜力，因此常被用来作为药物或各种造影剂的载体。脂质体可以以包封、膜标记、表面螯合、远端装载等方式与药物和造影剂结合，并在温度、pH、超声等的作用下进行可控的药物释放，因此脂质体在诊疗一体化方面有很多运用，可以根据实际情况的要求进行某种药物和单个成像模式的一体化，也可以对多种成像模式进行一体化。本问对脂质体作为药物和造影剂载体在
2、癌症的诊断和治疗方面的最新应用作一综述。关键词：脂质体；靶向载药；造影；诊疗一体化引言脂质体是一层或多层磷脂双层膜分散在水中形成的一个类球状、包封一部分水相的封闭囊泡。早在1947 年 Bernard 就提出了这种存在于水性体系中的两亲分子囊泡性结构的假设，但直到 1962 年剑桥大学动物生理学研究所装备了电子显微镜后，Alec D. Bangham 才和他的同事于 1965 年正式提出脂质体的概念 【1】 。由于磷脂双分子层具有和细胞膜类似的结构，所以其具有良好的生物相容性。脂质体进入人体内会被网状内皮系统吞噬，主要在肝、脾和骨髓等组织器官中积蓄，从而具有天然的被动靶向性；如果再对其修饰上特
3、定的配体，又可主动的靶向某些部位。这些性质使其可作为良好的药物和其他试剂的载体。人体的内部结构和功能一般是看不见的，但人们借助各种科学技术将人体内部结构和功能形成图像，从而检视人体，进行诊断和治疗，这就是医学成像的目的。1895 年伦琴发现 X 射线后不久医生就将其应用于医学。从 20 世纪 50 年代开始，医学成像的发展突飞猛进，新的成像系统相继出现。X 射线包括 CT主要用于观察人体形态学上的特征。采用放射性核素的核素成像可以了解脏器的生理功能。单光子发射CT(SPECT)和正电子发射 CT(PET)利用失踪动力学模型，显示了活体对注入药物的体内代谢过程，使许多疾病的研究和诊断大为深入。磁
4、共振成像(MRI)从另一角度些事了人体内部状况，它的图像与体内生化过程有关；它既是功能性的又比核素成像更清晰，而且对人体损伤很小。超声成像与这些方法相比价格低廉，使用方便，对人体基本无损，因此得到广泛应用，成为常规的首选成像手段之一 2.在成像技术中为了得到信号或增强信号需要用到显影剂或造影剂，脂质体具有作为这些试剂载体的潜力。随着科技的发展，成像技术在许多疾病特别是癌症的诊断和治疗中的重要性急剧增加。在纳米医学领域，成像和治疗结合的趋势明显。经过改造的脂质体可以选择性的靶向肿瘤组织，并能同时携带药物和造影剂，这使得脂质体在诊疗一体化方面有很大的潜力。本文将重点对脂质体作为抗肿瘤药物和各类成像
5、技术中(CT、核素成像、MRI、超声成像)的应用情况作一综述。1 脂质体作为抗肿瘤药物载体的应用癌症是人类的大敌，目前治疗癌症的主要手段还是化疗，而提高化疗效果的关键是提高药物的靶向性和降低药物的毒副作用。脂质体作为抗癌药物载体的几个关键问题是如何提高药物的包封率、靶向性及达到选择性释放的目的。1.1 载药脂质体的制备技术简介 【3】载药脂质体的制备涉及到两个重要方面：一是脂质体的形成，二是药物的装载。如果脂质体形成和药物装载在同一步完成，则称为被动载药制备技术。如果先形成空白脂质体，再借助特定的梯度来实现药物的装载则称为主动载药制备技术。1.2.1 被动载药制备技术被动载药制备技术通常只适用
6、于那些和脂类物质(尤其是磷脂)有强烈互相作用的脂溶性或亲脂性药物，否则就会造成：药物的包封率和载药量不足；当脂质体以液体形式储存时，药物会从脂质体中大量渗漏；对稀释效应特别敏感。影响脂质体体外稳定性和体内行为的因素主要有尺寸及分布、磷脂组成、胆固醇含量、层数，以及上述因素决定的荷电性，相转换温度 Tm以及膜的通透性、弹性、刚性等。选择合适的制备方法，就是要对上述因素进行控制。鉴于脂质体的制备方法众多，有必要采取一个合理的分类手段，下面就以出发体系的不同分类归纳。以干燥的脂膜、脂类粉末为基础的制备方法有：薄膜分散法、有机溶剂冻干法、喷雾干燥法、硫化床包衣法、单相溶液冻干法。以乳剂为基础的方法有：
7、反相蒸发法、二次乳化法。以混合胶团为基础的脂质体制备方法。以乙醇、磷脂、水三相混合物为基础的脂质体制备方法。1.2.2 主动载药制备技术使用主动载药技术，对药物的性质有较严格的要求。需要药物在生理 pH 值附近有可以离解的基团，具有合适的油水分布系数，并且和脂质体的内相缓冲液可以生成稳定程度恰当的复合物或者沉淀。其制备工艺通常包括：制备空白脂质体；通过透析、柱层析等手段创造特定的梯度；在合适的温度下，将膜内外已经形成梯度的空白脂质体和待包封的药物孵育，以完成药物的装载。最常用的梯度为 pH 梯度和硫酸铵梯度法。1.2 脂质体对肿瘤组织的靶向技术 【3】被动靶向是依赖于人体器官或组织本身的生理特
8、征和差异而达到选择性富集的目的。由于肿瘤的快速且不受控制的生长和组织的炎症会造成血管泄漏，这种泄漏的血管的内皮细胞层之间的间隙可达到700nm,这使得脂质体能够外渗到病变组织的细胞外空间。由于肿瘤组织中淋巴系统的失效和血管与间隙之间的压力差使得脂质体会滞留在细胞外空间。这被称为实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR-effect)，被动靶向就是运用这种效应达成的。如果通过在脂质体表面连接特定的配体就可以靶向那些肿瘤组织中过表达的受体或肿瘤血管上高表达的标志物。这就能实现脂质体的主动靶向，主动靶向也可结合 EPR-effect 来达到脂质体在肿瘤部位的累积。 靶向配体包括抗体、抗体片段、多肽、核酸适
9、配体以及一些小分子如叶酸和糖类。应该注意，无论哪种靶向技术都要面临传统脂质体在体内容易被网状内皮系统吞噬的问题，所以延长脂质体在体内的存留时间提高在体内循环的稳定性是非常重要的，通常可采用不同长度的脂肪酸链、不同的饱和度、改变荷电性以及采用空间稳定剂等方法实现。最常用的就是采用聚乙二醇(PEG)来保护脂质体。各种配体也可接到 PEG 上来实现靶向。被动靶向和主动靶向的示意图参见图 1。图 1 脂质体体内被动靶向和主动靶向肿瘤组织的示意图 【4】1.3 脂质体的选择性释药技术在脂质体的设计中，通过外力或利用一些物理化学因素的改变可使脂质体膜的通透性发生明显改变，引起脂质体选择性的释放药物。常见的
10、有温度敏感脂质体、pH 敏感脂质体、声波敏感脂质体等，这些技术可以单独使用也可以结合起来使用。下面结合最新研究进展分别介绍。1.3.1 通过温度控制脂质体药物释放不同温度下磷脂膜可以有不同的相，随着温度的升高，磷脂膜从紧密排列的凝胶态转变为疏松混乱的液晶态，膜的流动性也增大。这种结构的变化导致脂质体膜的通透性发生改变，从而到达选择性释放的目的。传统的温度敏感脂质体常选用相转变温度略高于人体温度的天然磷脂(如二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC，相变温度 41)或合成聚合物来制备，再在肿瘤部位进行热疗。最近出现了用亮氨酸拉链组装到磷脂双分子膜的脂质体装载阿霉素进行体外实验的报道 5,这种温度敏感的多肽可以
11、在温度的调控下最大化药物释放率。其机理如图 2 所示。图 2 脂质-多肽杂合体在受热时的反应示意图 51.3.2 通过 pH 控制脂质体药物释放pH 敏感脂质体是一种由不饱和的PE和脂肪酸组成的在酸性条件下主动释药的脂质体。其原理是: 脂质体被细胞内吞后, 形成核内体。核内体为酸性, 使脂肪酸羧基质子化, 发生膜融合, 药物便释放到胞浆, 避免进入溶酶体被降解。目前为了提高抗癌药的疗效, 几种抗癌药的pH 敏感脂质体制剂已被研制。最近有靶向线粒体且分阶段 pH 响应的脂质体作为抗癌药物载体的报道 【6】 ，该脂质体是基于一种两性寡肽脂质体(HHG2C 18-L), HHG2C18-L 由两部分
12、组成：一部分亲水，由带有两个氨基酸基团(谷氨酸和组氨酸)和一个对 pH 响应性分解的基团(氨基六氢苯甲酸)组成；另一部分疏水，由两条硬脂烷烃链组成。可以在体内不同的微环境下做出相应的反应。详细过程参见图 3。图 3 装载抗癌药物的 HHG2C18-L 在肿瘤细胞外和细胞内的分阶段 pH 响应并靶向线粒体过程的示意图 61.3.3 通过超声控制脂质体药物释放超声对脂质体释药的控制可通过超声的致热效应或非致热效应的方式来达成。通过高强度聚焦超声(HIFU)可以非侵入性的定位控制温度敏感性脂质体 7，如图4所示。通过低频率超声(LFUS)通过非致热效应来控制脂质体释放药物可以不改变药物的化学完整性或
13、生物效力，这里我们重点介绍一下利用低频超声的非致热效应。图 4 温度敏感脂质体在 HIFU 作用下释药示意图 7低频超声可以使脂质体释放药物的重要原因是可以在磷脂双分子膜上形成瞬时孔隙。形成机解释制如下：当脂质体置于超声场中，在磷脂双分子膜的疏水部分会形成一个气体球形核，气核生长至穿透磷脂膜，形成一个穿孔，此时药物就可以从脂质体的水相内核释放到脂质体外的水相中；然后磷脂膜松弛并回复到初始状态 8。如图4所示。图 5 脂质体在 LFUS 作用下产生瞬时孔隙的示意图 82 脂质体在医学成像及诊疗一体化中的应用在运用脂质体作为各种成像技术的显影剂载体时，一种思路是按成像原理的不同分开研究的。也取得了
14、很多进展，如用碘化的脂质体造影剂作为CT成像在老鼠原发肺癌的诊断中的应用 9,利用脂质体作为放射性核素的载体用于SPECT和PET在肿瘤诊断中的应用已经有了综述 4,利用脂质体携带磁性纳米颗粒作为MRI在肿瘤的诊断中的应用也有了综述 7,10,脂质体作为超声成像的造影剂在上世纪九十年代研究较多，也有过专利 11,近期在超声造影方面应用较多的是纳米微气泡，因为这种微气泡含有更大的气体内核，但实际上和脂质体也是密不可分的 12。由于各种成像技术都有各自的优点和不足，在诊断方面人们越来越倾向于多种成像技术同时运用，这样可以同时从不同的方面来了解患者的状况；由于很多时候体内输送药物和运送造影剂用的是类
15、似的系统，人们也更倾向于将诊断和治疗合二为一，即将成像和载药结合起来，这样可以提高效率也可以对于药物治疗的效果进行实时的监控。下面将结合最近的几篇有代表性的文献来介绍一下多种成像的综合运用以及诊断治疗一体化方面的进展。2.1 造影剂与脂质体的结合不同的显影剂或造影剂的性质各异，但与脂质体的结合方法可以归纳为四类：被动包封、膜标记、表面螯合、远端装载。这里用放射性核素标记脂质体的示意图来说明，如图4所示。图 6 放射性脂质体制备方法示意图 42.2 利用 MRI 引导 HIFU 来控制热敏性脂质体释药 【7】温度敏感性脂质体的概念前面已经介绍过，临床上的加热方式主要有水浴、光照、基于针尖的射频、
16、导管加热等；利用高强度聚焦超声作为一种无损、定位、可控的加热方式展现出很大的应用前景。将药物和MRI造影剂同时包封于脂质体内，就可以实现载药和造影的双重功效。如图7所示。图 7 脂质体同时装载阿霉素和 MRI 造影剂并在温度控制下释放的示意图 7利用MRI引导HIFU可以实现体内深部的精确靶向定位和实时温度变化定量控制，这样就可以先用MRI对肿瘤的治疗制定计划，在治疗中可以提供温度及空间的反馈，也可以对治疗效果进行评价。整个过程参见图8的循环。这样一个系统可以显著提高靶组织的药物聚集量。 图 8 72.3 同时装载顺磁性、荧光、SPECT/PET 造影剂的脂质体用于多模态成像 【13】MRI
17、是一种非侵入性的和广泛使用的成像模式，能产生良好的软组织对比度和空间分辨率。然而MRI 的灵敏度不高，因此目标需要被高表达或增加对比度。相反，PET 和 SPECT 成像方法具有很好的灵敏度，但空间和时间分辨率的灵敏度有限。因此有必要结合这些成像模式来阐明脂质体从细胞水平到宏观水平的生物行为。能将载药系统和这些成像模式结合就更有意义了。这里介绍一种多功能，多模式的组装脂质体剂型，包括：含有短的 n-乙二醇(n-EG)单元的脂质用于在体内包覆脂质体，连接 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的脂质可以在体内螯合顺磁性离子或放射性核素，荧光标记的脂质体用于光学成像
18、，辅助性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。并设计合成了三种在 DOTA 和磷脂酰基链间有不同长度的 n-EG 的脂质。在 DOTA 极性头上接上顺磁性的 Gd3+离子，就可以使脂质体成为 MRI 造影剂，接上放射性离子 64Cu 和 111In，就可以作为 PET 或 SPECT 的示踪剂。为了能延长循环时间及更好的靶向我们采用 PEG2000 修饰的脂质体。详细如图 9 所示。图 9 133 结语脂质体由于其良好的生物相容性，靶向性和膜通透性的可控性，作为药物的载体和造影剂的载体的研究已经开展的很多年了。多功能的脂质体结合药物的运输和体内的造影是很有吸引力的，因为可以同时对疾病进行监控和治
19、疗。更进一步，这种诊疗一体化的脂质体能够在早期就优化个体病人的治疗方案，从而增加癌症病人存活的希望。参考文献：1 JONES M N. The Surface Properties of Phospholipid Liposome Systems and Their characterization J. Advances in Colloid and Interface Science, 1995, 54(3): 93-128.2 顾立本， 万遂人， 赵兴群. 医学成像原理M. 第一版. 北京: 科学出版社, 2012.3 邓英杰. 脂质体技术M. 第一版. 北京: 人民卫生出版社, 200
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