1、一、实验目的1、 通过对比实验来研究哪种方法能达到最佳的实验效果。2、建议学生对所取的菠菜与酒精的量的比例作一研究（可以采用 10g 菠菜叶与 5ml 无水酒精组合、10g 菠菜叶与 10ml 无水酒精组合、5g 菠菜叶与 5ml 无水酒精组合、5g 菠菜叶与 10ml 无水酒精组合等） ；3、接采用载玻片的一侧蘸取匀浆，压在滤纸条上二、实验原理叶绿体中的色素溶解于有机溶剂酒精或丙酮，根据此原理可以将叶绿体中的色素提取出来，形成色素液。色素在层析液中的溶解度不同，因而随层析液在滤纸上扩散的速度不同，溶解度越高，扩散速度越快，溶解度越低，扩散速度越慢。根据此原理使各种色素分离开来。老嫩适中且浓绿
2、的叶，叶绿素含量比较多。三、基本操作训练： 【操作步骤】1、菠菜色素的提取取 2g 新鲜菠菜叶，与 10mL 甲醇拌匀研磨 5 分钟，弃去滤液。残渣用 10mL 的石油醚-甲醇（3:2）混合液进行提取，共提取两次。合并液用水洗后弃去甲醇层，石油醚层进行干燥、浓缩。2、薄层层析将上述的浓缩液点在硅胶 G 的预制板上，分别用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）两种溶剂系统展开，经过显色后，进行观察并计算比移值。3、柱层析取 3g 中性氧化铝进行湿法装柱。填料装好后，从柱顶加入上述浓缩液，用石油醚-丙酮（9:1） 、石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）进行洗脱，依次接
3、收个色素带，即得胡萝卜素（橙黄色溶液） 、叶黄素（黄色溶液） 、叶绿素 a（蓝绿色溶液）以及叶绿素 b（黄绿色溶液） 。【实验流程】过滤 萃取 洗涤、蒸馏萃取液菠菜 菠菜汁浸膏薄层层析柱层析Rf 值色带、溶液研磨 石油醚甲醇 水四、实验关键及注意事项注意薄层色谱、柱层析实验操作要点的掌握和应用五、提问纲要试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？六、主要试剂用量、规格新鲜菠菜 2g、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇 10ml、硅胶 G、中性氧化铝七、时间分配及控制计划安排：4h1 滤液过稀提取色素液操作时，方法欠妥，滤液黄绿色，浓度稀，实验效果欠佳，只有深绿透
4、明的滤液，才能达到好的分离效果。1.1 绿叶材料选用不当，有关资料上介绍的绿叶材料，不都是效果最优的，不能盲从。选用老叶、革质、蜡质的叶片，就难以研磨充分。宜选老嫩适中且浓绿的叶，如：菠菜、青菜、天竺葵、马铃薯、苷薯的叶。 1.2 所选叶片剪得不碎，加之研磨不充分。实验操作时，尽可能剪碎叶片，可把几张叶片叠放一起，先剪成丝，再一起横着剪碎，这样省时省力。加入少许 SiO2，CaCO3 且迅速充分研磨，研 120 转左右，使研磨液呈匀浆状为好，这样各种色素才能充分溶解在提取液里(丙酮或无水乙醇)。1.3 过滤时，漏斗基部的脱脂棉太多(或“尼龙布“不是单层) 。过滤时，使用脱脂棉尽可能少，便于得到
5、深绿色的透明滤液，能阻挡住叶渣即可。切忌用过滤纸过滤，否则色素被吸收，降低滤液中色素的浓度。 1.4 加入提取液过多，导致滤液中色素含量低。对策是将稀提取液和新添碎叶放入研钵再研。此法也是上述的补救措施。2 滤液不纯提取液含有过多的杂质或变质，会严重影响实验结果。2.1 叶片表面含有水珠或叶片内含水量过高，降低提取液对色素的抽提效率，且影响层析。对策是用吸水纸或脱脂棉擦去叶片表面水珠，不用过嫩的叶，必要时加少许脱水剂硫酸钠。 2.2 加入过多的二氧化硅和碳酸钙，这样既影响过滤，又使滤液中有颗粒物，降低滤液浓度。对策是控制用量，一般各加 0.1g。(SiO2 起研磨粉作用，破坏细胞结构。CaCO
6、3 与有机酸反应，是叶绿素的保护剂) 。2.3 滤液存放时间过长，光线和空气的作用，缓慢的有机反应，将溶解的色素破坏，溶液变为褐色，即叶绿素卟啉环中的镁可被 H+或Cu2+所取代。液泡膜破裂流出的鞣酸、草酸等有机酸产生的 H+置换了叶绿素中的镁后，可以形成褐色的去镁叶绿素。3 定性滤纸不合要求3.1 定性滤纸久露空气中，已吸湿。简便易行的做法是放在酒精灯火焰上方快速烘干。平时注意用塑料袋封存，随用随取。3.2 定性滤纸有皱折，或被手弄脏，影响层析。须换新滤纸。4 滤液线画得过细画好滤液线既是实验的难点，又是实验的关键，否则现象不明显。4.1 滤液线画得不匀实。原人教版教材上讲越细越齐效果越好，
7、新老教材上都讲画滤液细线，极易产生误导。导致学生画的滤液线过浅，线上色素量太少，其实最关键的是画线后绿色较深。实际操作中，每画一次、用电吹风吹干，可重复几次，便于积累色素成分，力求深、齐、匀，线粗 12mm，可用医院验血时用来吸血的毛细吸管画。4.2 滤液线画得距滤纸剪角端太近，易使色素溶解于层析液中，不能在滤纸条上向上扩散，距剪角端 1.5cm 处画线，层析速度适中，效果最佳。5 层析液欠佳，层析操作欠妥层析液的配制是实验成败的又一关键，层析操作是实验的另一难点。5.1 有关资料上介绍的层析液配方，效果远远不及教材上提供的以石油醚为主的配方。5.2 层析时，滤纸条与沾有层析液的烧杯内壁紧贴，
8、造成色素部分溶解。可将滤纸条画线端朝下，轻轻地插入到层析液中，滤纸条斜靠着烧杯内壁。此外，烧杯中层析液的量以约 1cm 高为好。分组实验时，层析液可重复使用，前一组学生实验结束后不可洗烧杯，否则烧杯内壁有水，会影响后一组学生实验效果。 6 冬季气温低等冬季气温低，分子扩散速度慢，可用酒精灯微微加热加快层析速度。总之，在进行该实验时，应规范实验操作程序，培养学生严谨作风，严格挑选配制层析液的配方，抓住实验的难点画滤液线和层析操作，仔细观察，深刻理解色素分离的内涵，才能走出实验的误区，获得滤纸条上出色的展现四条不同色素带的明显实验效果。 1提取液的改进除丙酮外，也可用酒精替代，结果大致相同。和酒精
9、相比，丙酮有一定毒性，因而不妨换一下；另外一种提取液是：在加入丙酮 23ml 后，再加入 2ml 石油醚，可以提高胡萝卜素提取效果，色素带分离现象更明显。2层析液的改进层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂，教材上给出了两种层析液配方：一种是 93 号汽油，另外一种为 20 份石油醚，2 份丙酮，l 份苯混合而成。采用下列配方实验效果也不错：（1）四氯化碳加少许无水硫酸钠；（2）95的酒精；（3）9 份 95酒精加 1 份苯；（4）20 份汽油，2 份丙酮，2 份石油醚，1 份苯。其中，采用配方（4）效果最好，配方（2）经济而且简便一些，但效果有一定折扣。3设立对照实验设立一个空白对照组，在其他条件
10、完全相同的情况下，一个画滤液细线，而另外一个不画，结果进行对照，消除“不同色带是层析液在滤纸上扩散后留下的颜色”的怀疑。这样同时也培养严谨的实验作风，体现生物学科研的基本原则。为了强调不要使层析液浸没滤液细线的意义，也可以设立这样一个浸没滤液细线的对照组，结果会发现色素被溶解下来，而无法分离。4实验方法探索本实验不仅可用条形滤纸进行层析，还可以采用圆形滤纸层析办法：取平面培养皿 1 只，铺一层细纱(厚约 05cm)，将滤纸剪为圆形放人培养皿中，在圆形滤纸中央点上滴 2 滴色素提取液，静置约 1min，然后依次滴 35 滴层析液，每滴中间间隔30s，然后盖上培养皿盖，几分钟后，可以观察结果会得到近似同心圆的 4 个色素环，由内而外分别是黄绿色、蓝绿色、黄色、橙黄色。此实验关键有两点：一是几次滴液体要在同一点上，否则不能形成圆环；二是滴层析液的量和时间要掌握好，否则会影响效果，甚至失败。
