1、实验一 木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。木瓜蛋白酶最适 pH 随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适 pH为 7。据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在 pH7.2 的磷酸缓冲液、 35条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在 275nm 处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木
2、瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。考马斯亮蓝 G-250 在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。2、试剂：0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.2） ；1%的酪蛋白溶液：称 1g 的酪蛋白用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.2 ）配至100mL；激活剂：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L 的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称 10g 的 TCA 定容至 10
3、0 mL；考马斯亮蓝 G-250：称 0.1g 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50mL90%乙醇溶液中，加入 85%磷酸溶液 100mL，用蒸馏水定容到 1000mL。3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。四、实验步骤 1木瓜乳的采集 选取挂果 30 天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约 3mm 的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。2木瓜蛋白酶的提取用小烧杯称取木瓜乳约 0.15g，准确记录其质量 M(
4、g)。用量筒量约30mL0.1 mol/L 的磷酸缓冲液，用少许磷酸缓冲液将木瓜乳转移至研钵，并研成匀浆，将匀浆液过滤至量筒中，将剩余的磷酸缓冲液分次洗涤研钵，洗涤液与匀浆液一同收集过滤于量筒中。读取量筒中收集到的滤液体积 V(mL)，放置备用。3木瓜蛋白酶活力的测定自定义酶活力单位（U） 。本实验木瓜蛋白酶活力的定义为：在当前测定条件下，测定体系在 275nm 波长下，每增加 0.001 的吸光度为 1 个酶活力单位。单位体积酶样的活性：a （ U/mL）=OD 275nm/(10min0.0010.1mL)木瓜蛋白酶活力的测定步骤见下表：样品 测定步骤待加试剂酶液（mL）10%TCA（mL
5、）激活剂（mL）1%酪蛋白10%TCA（mL）对照管（1 管）0.1 1 1.9 1 0反应管(2 管)0.1 0 1.935保温10min 1摇匀35反应10min1过滤，测滤液的OD275nm4蛋白质含量测定采用考马斯亮兰 G-250 法。具体测定步骤见下表：样品 0.1mol/L 的磷酸缓冲液（mL）酶液（mL ）考马斯亮蓝 G-250（ mL）对照管（1 管） 0.1 0 5反应管（2 管） 0 0.1 5摇匀，室温下放置 5min，测溶液的OD595nm根据经验公式计算获得木瓜乳提取液中蛋白质的含量：b(mg/mL)=2*A 595nm五、 数据处理及计算1、单位体积的酶活力（U/mL）2、总酶活力（U）3、蛋白质含量（mg/mL）4、比活力（U/mg 蛋白）5、木瓜蛋白酶得率（U/g 木瓜乳）
