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聚合酶链反应检测病原真菌及新生隐球菌的实验研究.doc

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资源描述

1、聚合酶链反应检测病原真菌及新生隐球菌的实验研究2009-11-15 顾菊林 廖万清 柴建华 【摘要】 目的 使临床系统性真菌病的诊断提高到分子水平。方法 首先应用一对外侧的基于 rDNA 的真菌通用引物进行 PCR 扩增,此后应用新生隐球菌种特异性内侧引物对首轮扩增产物进行第二轮扩增鉴定。结果 应用外侧引物对能对代表 8 属 17 种的 25 株医学重要真菌进行扩增,而对所有细菌和人 DNA 均为扩增阴性,内侧引物对仅对新生隐球菌获得扩增。应用两轮 PCR 扩增(通用 PCR 和随后的种特异性 PCR)方法从获得临床标本到鉴定病原菌仅需 8 小时。结论 这种依据 PCR 的检测和鉴定系统为临床

2、快速诊断系统性真菌病提供了一种全新的实验方法并可望应用于临床。 【关键词】 真菌病 隐球菌,新型 Experimental study on detection of pathogenic fungi and cryptococcus neoformans by polymerase chain reaction Gu Julin, Liao Wanqing, Chai Jianhua. Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 【Abstract】 Objective The object

3、ive of the study was to develop the diagnosis of systemic mycoses to the sphere of molecular biology. Methods With the nested-PCR methodology, a method for detecting fungal pathogens in clinical specimens was developed. The complete strategy consists of PCR amplification with the external fungal uni

4、versal primers for rDNA and amplicon identification by the second cycle PCR amplification with the cryptococcus neoformans species-specific primer pair. Results The external universal primers were capable of amplifying DNA from 25 strains representing 17 species (8 genera) of medically important fun

5、gi. Neither human nor a varity of pathogenic bacteria gave an amplified product. The internal species-specific primers amplified DNA only from Cryptococcus neoformans. The use of these two PCRs in tandem allows the detection (universal PCR) and identification (species-specific PCR) of a fungal patho

6、gen within 8h from clinical specimens. Conclusion This PCR-based detection and identification system provides a rapid laboratory method for the diagnosis of systemic mycoses and shows its potential for clinical applications. 【Key words】 Mycoses Cryptococcus neoformans 医学上重要真菌传统上主要依据形态学和生理学等表型特征进行鉴定,

7、但这些方法往往费时费力。由于近年来在 AIDS、血液系统肿瘤以及移植等患者中由机会性真菌感染所致的发病率和死亡率呈日益上升的趋势,因而迫切要求发展鉴定病原真菌的新方法。对真菌菌种菌株进行遗传鉴定的分子方法为鉴定和检测病原菌提供了简便、快速和准确的方法。我们将聚合酶链反应技术用于病原真菌及新生隐球菌的检测,现将结果报告如下。 材料和方法 一、材料 (一) 菌株 白念珠菌 ATCC76615、067,类星型念珠菌 C1,克柔念珠菌 R5,高里念珠菌 D10,热带念珠菌 D9,乳酒念珠菌 D12,光滑念珠菌 C2,新生隐球菌D48、RV45981、RV59939、RV52642、RV45977,罗伦

8、特隐球菌 C3,黄曲霉 C4,烟曲霉 C5,产黄青霉 C6,酿酒酵母 C7,裴氏瓶霉 C8,皮炎瓶霉 C9,蓝色犁头霉 030、057,少根根霉023、056 由本院真菌室提供;脑膜炎奈瑟菌,结核分枝杆菌,大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,肺炎球菌,-溶血性链球菌,-溶血性链球菌由第二军医大学微生物学教研室赠送。 (二) 主要试剂和仪器 Novozyme 234 (Novo Biolabs 公司),Lyticase (Sigma),Taq DNA 聚合酶(GIBCO BRL),PCR 仪(PT-100,MJ Research)。 二、方法 (一) 菌株和细胞系 DNA 的制备 真菌 DNA 制备采用

9、高盐法1 。细菌和人白细胞 DNA的制备按文献进行2 。 (二) 临床标本的预处理 参照 Buchman 等3介绍的方法并作适当修改。 (三) PCR 扩增 参照文献4,5 ,我们在 5.8 rDNA 的附近选择了两对套式 PCR 引物。外侧的引物对 ITS1-ITS4 为预期的真菌通用引物对,序列为:ITS1 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3,ITS4 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。内侧的引物对 CN1-CN2设计为新生隐球菌种特异性引物对,序列为:CN1 为 5-ATCACCTTCCCACTA- ACACAT T-3,CN2 为 5-GAAGGGCATGC

10、CT- GTTTGAGAG-3。首先使用外侧引物对进行 PCR 扩增(ITS-PCR),作为套式 PCR 的第一轮反应。第二轮:以第一轮 PCR 的反应产物为模板用内侧引物对 CN1-CN2 进行第二轮扩增(CN-PCR)。 结果 一、ITS-PCR 检测真菌 DNA 所有用于本项研究的代表 8 个真菌菌属、17 个真菌菌种的 24 株真菌 DNA 均扩增出单个的 PCR 产物,各菌种的 PCR 产物大小存在明显的多态性,绝大多数 PCR 产物大小为500650bp。7 株细菌菌株 DNA 和 4 份人白细胞 DNA 则为扩增阴性。 二、ITS-PCR 检测模拟临床血标本的敏感性 将在 YEP

11、D 中生长的白念球菌 ATCC76615 连续稀释在健康人血中,模拟临床血标本进行PCR 扩增。结果经 PCR 扩增最低可检出 10CFU 的真菌细胞(附图),在不同日期重复实验,获得 PCR 检出水平约在 510CFU 范围内。 三、新生隐球菌种特异性引物的鉴定 5 株不同血清型的新生隐球菌菌株 DNA 均扩增产生 136bp 的片断,与预期产物长度相符。而其 泳道 1-4:白念珠菌 CFU 依次为 103,102,10,1。泳道 5,模拟标本中无白念珠菌;泳道6,无模板 DNA(双蒸水)。泳道 7 为阳性对照,白念珠菌 DNA。泳道 M 为核苷酸分子量标记pGEM-3Zf(+)/Hae 。

12、 附图 ITS-PCR 检测模拟临床血标本的敏感性 它种的真菌和细菌以及人白细胞 DNA 均为扩增阴性。模拟临床标本的新生隐球菌检测,经CN-PCR 扩增最低可检出 15CFU 的新生隐球菌。 四、临床标本的检测 对 22 例我室保藏的临床脑脊液及非脑脊液标本应用上述 PCR 方法进行了回顾性研究。结果表明,所有真菌镜检或培养阳性的 10 例标本 ITS-PCR 检测阳性;另有 1 例真菌培养阴性标本应用 ITS-PCR 亦获得了扩增。新生隐球菌种特异性 CN-PCR 检测结果表明,上述 11例 ITS-PCR 扩增阳性的标本中仅有 4 例 CN-PCR 扩增阳性,而这 4 例标本此前经培养鉴定为新生隐球菌,其余 18 例新生隐球菌镜检或培养阴性的标本均未获得扩增。

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