细胞生物学实验设计.doc

1、设计实验 1. 细胞概述1. Miller 证明地球上的有机分子自动合成的装置( 图 E1-1)（答案） 播 放 动 画 答 : Miller 推 测 ,大 气 层 中 含 有 甲 烷 和 氨 ,也 含 有 氢 和 水 蒸 气 。 他 把 这 些 气 体 一 起 放 入 实 验 装 置中 （ 图 E1-1） ,然 后 一 直 与 电 火 花 接 触 ,在 这 一 装 置 中 靠 沸 水 提 供 水 蒸 气 。 反 应 一 个 星 期 后 分 析 产物 。 令 人 惊 讶 的 是 ,产 物 中 有 大 量 的 有 机 物 ,包 括 尿 素 、 生 物 和 非 生 物 的 氨 基 酸 等 , 实

2、验 证 明了 在 雷 电 作 用 下 能 够 利 用 大 气 中 的 分 子 合 成 有 机 分 子 。 也 就 是 说 在 进 化 的 某 一 过 程 中 地 球 上 有 了 构成 细 胞 生 命 物 质 的 基 本 元 件 :氨 基 酸 、 碱 基 、 单 糖 等 ,为 细 胞 的 起 源 作 好 了 物 质 准 备 。图 E1-1 Miller 证 明 地 球 上 的 有 机 分 子 自 动 合 成 的 装 置 设计实验 2.细胞生物学研究方法1. 1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 发明的单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique

3、)的实验原理和技术细节有哪些?（答案） 播 放 动 画 答 :1975 年 英 国 科 学 家 Milstein 和 Kohler 发 明 了 单 克 隆 抗 体 技 术 ,因 此 获 得 1984 年 诺 贝 尔医 学 奖 。 它 是 将 产 生 抗 体 的 单 个 B 淋 巴 细 胞 同 肿 瘤 细 胞 杂 交 的 技 术 ， 其 原 理 是 : B 淋 巴 细 胞能 够 产 生 抗 体 , 但 在 体 外 不 能 无 限 分 裂 ;而 瘤 细 胞 虽 然 可 以 在 体 外 进 行 无 限 传 代 ,但 不 能 产 生抗 体 。 将 这 两 种 细 胞 融 合 后 得 到 的 杂 交 瘤

4、 细 胞 具 有 两 种 亲 本 细 胞 的 特 性 , 既 能 产 生 抗 体 ,又能 无 限 增 殖 。图 E2-1 所 示 是 单 克 隆 抗 体 制 备 流 程 。 首 先 用 一 种 抗 原 注 射 小 鼠 ， 引 起 产 生 特 异 抗 体 的 细 胞 大 量增 殖 ,取 出 小 鼠 的 脾 ,分 离 产 生 抗 体 的 淋 巴 细 胞 ， 同 骨 髓 瘤 细 胞 进 行 融 合 ， 在 HAT 培 养 基 上 进行 初 步 筛 选 后 ， 经 过 进 一 步 鉴 定 ,得 到 生 产 单 克 隆 抗 体 的 细 胞 。图 E2-1 单 克 隆 抗 体 技 术筛 选 用 的 HAT

5、 培 养 基 是 选 择 性 培 养 基 ， 含 有 氨 基 喋 呤 (aminopterin,A)、 次 黄 嘌 呤(hypoxanthine,H) 和 胸 腺 嘧 啶 (thymidine,T)。 在 HAT 培 养 基 中 ， 只 有 肿 瘤 细 胞 和 正 常 细 胞 融 合形 成 的 杂 交 瘤 细 胞 才 能 生 存 ， 而 未 融 合 的 肿 瘤 细 胞 、 正 常 细 胞 及 非 肿 瘤 细 胞 和 正 常 细 胞 融 合 形 成 的细 胞 都 会 死 亡 。 因 为 ， 正 常 的 未 融 合 细 胞 具 有 核 酸 合 成 主 要 通 路 和 旁 路 所 必 需 的 酶 但

6、 不 能 在 体 外 长期 生 长 ； 突 变 后 的 肿 瘤 细 胞 只 具 有 RNA 和 DNA 合 成 所 必 需 的 主 通 路 的 酶 ， 而 缺 乏 利 用 胸 腺 嘧啶 核 苷 合 成 DNA 的 胸 腺 嘧 啶 核 苷 激 酶 (TK)或 缺 乏 利 用 次 黄 嘌 呤 合 成 RNA 的 磷 酸 核 糖 转 移酶 (HGPRT)。 当 这 些 细 胞 的 核 酸 合 成 主 通 路 被 培 养 基 中 氨 基 喋 呤 阻 断 后 ， 则 因 核 酸 合 成 障 碍 而 死 亡 。只 有 肿 瘤 细 胞 和 具 有 合 成 旁 路 酶 的 正 常 细 胞 形 成 的 融 合

7、细 胞 ， 才 能 在 氨 基 喋 呤 、 次 黄 嘌 呤 和 胸 腺 嘧啶 核 苷 存 在 的 情 况 下 利 用 其 中 的 次 黄 嘌 呤 和 胸 腺 嘧 啶 核 苷 合 成 核 酸 而 得 以 生 存 。 由 于 融 合 细 胞 具 有肿 瘤 细 胞 和 抗 体 分 泌 细 胞 双 重 特 征 ， 所 以 在 去 除 氨 基 喋 呤 这 一 核 酸 阻 断 剂 后 即 可 在 正 常 培 养 基 中 长期 传 代 增 殖 ， 并 分 泌 抗 体 。 在 HAT 培 养 基 中 生 存 下 来 的 细 胞 ， 可 以 是 各 种 正 常 细 胞 与 瘤 细 胞 的融 合 体 ， 还 可

8、能 是 多 克 隆 杂 交 瘤 细 胞 的 混 合 群 体 ， 因 此 须 进 一 步 用 稀 释 法 分 离 出 单 克 隆 的 杂 交 瘤 细胞 和 筛 选 出 识 别 特 异 性 抗 原 的 抗 体 分 泌 克 隆 ， 才 能 最 终 得 到 特 异 性 单 克 隆 抗 体 杂 交 瘤 细 胞 株 。设计实验 3. 细胞质膜与跨膜运输1. Irving Langmuir 如何通过实验提出脂单层的设想？这一设想对膜结构的研究有何特长意义？（答案） 答 :关 于 细 胞 质 膜 膜 的 化 学 组 成 和 结 构 ， Irving Langmuir 通 过 展 层 实 验 ， 提 出 脂 单

9、 层(lipid monolayer)的 设 想 。 他 将 提 取 的 膜 脂 铺 展 在 Langmuir 水 盘 (Langmuir Trough)的 水 面 上 ,研 究 了 脂 的 展 层 行 为 ,发 现 脂 在 水 面 上 形 成 一 薄 层 。 他 用 苯 将 脂 溶 解 ,然 后 将 苯 -脂 溶 液 放 在 水面 上 展 层 ,当 苯 挥 发 后 ,留 下 的 脂 在 水 面 上 形 成 单 脂 层 (图 E3-1),亲 水 的 头 朝 向 水 面 ,疏 水 尾 背 离水 面 。 脂 单 层 概 念 是 20 世 纪 初 膜 结 构 研 究 的 基 础 ,导 致 后 来 脂

10、 双 层 的 发 现 。图 E3-1 脂 在 Langmuir 水 盘 中 展 现 单 脂 层水 盘 有 一 个 浅 盘 和 一 个 可 移 动 的 挡 板 组 成 。 移 动 挡 板 可 将 磷 脂 单 层 向 固 定 挡 板 端 挤 压 ,形成 致 密 的 单 脂 层 。1925 年 两 位 荷 兰 科 学 家 E.Gorter 和 F.Grendel 根 据 对 红 细 胞 质 膜 的 研 究 首 次 提 出 质 膜 的 基 本结 构 是 双 脂 分 子 层 。 他 们 看 到 了 Langmuir 的 研 究 论 文 ,认 为 可 以 用 展 层 方 法 研 究 红 细 胞 膜 脂 的

11、结 构 ,因 为 Overton 已 经 提 出 在 细 胞 的 外 层 有 脂 的 包 被 ,推 测 红 细 胞 的 表 面 也 有 脂 的 存 在 。 在 红 细胞 的 外 侧 包 被 中 有 多 少 脂 ? 尚 不 清 楚 。 但 是 ,他 们 在 显 微 镜 下 观 察 到 人 的 红 细 胞 是 扁 平 状 ,直径 约 为 7m。 根 据 红 细 胞 的 体 积 ,推 测 红 细 胞 的 表 面 积 约 为 100m2。 他 们 分 离 纯 化 了 红 细 胞 ,并 从 一 定 数 量 的 红 细 胞 中 抽 提 脂 类 ,按 Langmuir 的 方 法 进 行 展 层 ,并 比

12、较 展 层 后 脂 单 层 的 面 积 和根 据 体 积 所 推 算 的 总 面 积 。 比 较 的 结 果 , Gorter 和 Grendel 发 现 脂 铺 展 的 面 积 同 实 际 测 量 的 红 细胞 的 表 面 积 之 比 约 为 1.8 2.2 1， 为 了 解 释 这 一 结 果 ， 他 们 提 出 红 细 胞 膜 的 基 本 结 构 是 脂 双 层(lipid bilayer)。 同 时 ， 推 测 脂 双 层 具 有 热 力 学 的 特 点 ,认 为 极 性 的 亲 水 基 团 朝 向 外 侧 的 水 性 环 境 。他 们 的 实 验 和 依 据 实 验 所 得 出 的

13、结 论 具 有 非 常 重 要 的 意 义 ,这 是 人 类 第 一 次 从 分 子 水 平 研 究 细 胞膜 的 结 构 。2. 细胞膜上有很多蛋白,如何鉴定膜运输蛋白?（答案） 播 放 动 画 答 :目 前 有 两 种 鉴 定 方 法 (图 E3-2),一 种 是 亲 和 标 记 法 (affinity labeling),另 一 种 是 膜 重 建(membrane reconstitution)。图 E3-2 鉴 定 膜 运 输 蛋 白 的 两 种 方 法上 :亲 和 标 记 法 ,在 此 法 中 常 常 用 到 特 异 的 运 输 系 统 的 抑 制 剂 。 下 :膜 重 建 法 。

14、在 亲 和 标 记 法 中 ,主 要 是 用 放 射 性 标 记 的 分 子 抑 制 某 种 物 质 的 运 输 .这 种 抑 制 作 用 是 由 抑 制剂 同 膜 运 输 蛋 白 的 结 合 引 起 的 ,然 后 分 离 膜 蛋 白 ,鉴 定 同 抑 制 剂 结 合 的 膜 蛋 白 。 例 如 细 胞 松 弛 素 B是 葡 萄 糖 运 输 蛋 白 的 抑 制 剂 ,因 此 将 放 射 性 标 记 的 细 胞 松 弛 素 加 入 到 细 胞 液 中 ,就 可 同 膜 中 葡萄 糖 运 输 蛋 白 结 合 ,然 后 从 膜 中 分 离 蛋 白 ,通 过 放 射 性 分 析 鉴 定 膜 运 输 蛋

15、 白 。 在 膜 重 建 法 中 ,首先 要 分 离 纯 化 膜 蛋 白 ,然 后 将 分 离 纯 化 的 蛋 白 质 同 磷 脂 混 合 ,构 建 人 工 脂 质 体 ， 然 后 检 测 脂 质 体的 运 输 能 力 。3. 请设计一种方法检测跨膜蛋白的哪一部分位于膜的外侧,哪一部分位于膜的内侧? （答案） 答 : 用 相 对 分 子 质 量 大 而 不 能 透 过 细 胞 质 膜 的 胰 蛋 白 酶 处 理 胰 蛋 白 酶 完 整 的 细 胞 :这 种 处 理 可 以 将 跨 膜 蛋 白 的 朝 向 外 侧 的 肽 水 解 ,而 位 于 脂 双 层 和 细 胞 质 面 的 部 分 则 不

16、受 影 响 。 用 非 离 子 去 垢 剂 或 渗 透 休 克 提 高 膜 的 渗 透 性 ,让 膜 失 去 了 对 蛋 白 水 解 酶 渗 透 的 障 碍 作 用 , 结 果 使 膜 蛋 白 的 细 胞 质 部 分 被 蛋 白 酶 水 解 。处 理 的 结 果 可 以 通 过 SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 进 行 检 测 。 同 时 设 置 对 照 细 胞 。实 验 过 程 示 于 图 E3-3。图 E3-3 测 定 膜 蛋 白 在 膜 中 定 位 的 实 验 过 程设计实验 4. 细胞环境与互作1. 证明细胞具有识别能力的经典实验是什么?（答案） 播 放 动 画 5. 细胞通

17、讯1. 如何通过实验分离烟碱样乙酰胆碱受体并证明烟碱样乙酰胆碱受体证明具有通道偶联受体的作用?（答案） 答 :烟 碱 样 乙 酰 胆 碱 受 体 (nicotinic acetylcholine receptor)是 研 究 得 比 较 清 楚 的 离 子 通 道 偶 联受 体 ,它 存 在 于 脊 椎 动 物 骨 骼 肌 细 胞 以 及 某 些 鱼 的 放 电 器 官 细 胞 的 质 膜 上 ； 受 体 与 乙 酰 胆 碱 结 合 ,引 起Na+通 道 的 开 放 ,Na+流 入 靶 细 胞 ， 使 得 质 膜 去 极 化 并 引 起 细 胞 的 收 缩 。分 离 纯 化 乙 酰 胆 碱 受

18、 体 , 首 先 要 找 到 一 种 与 该 受 体 结 合 的 配 体 , 然 后 进 行 受 体 分 离 。 幸 运的 是 发 现 了 一 种 蛇 毒 毒 素 ， 使 得 受 体 的 纯 化 成 为 可 能 。-银 环 蛇 毒 素 (-bungarotoxin)是 一 种 小 分 子 的 蛋 白 质 ， 能 够 选 择 性 地 并 且 几 乎 是 不 可 逆 地 同 乙酰 胆 碱 受 体 结 合 。 这 些 毒 素 能 够 阻 止 乙 酰 胆 碱 同 受 体 相 互 作 用 ， 导 致 呼 吸 麻 痹 和 死 亡 。 利 用 放 射 性标 记 的 -银 环 蛇 毒 素 可 在 显 微 镜

19、下 确 定 组 织 切 片 中 的 乙 酰 胆 碱 受 体 的 位 置 ,以 及 检 查 纯 化 的 蛋白 样 品 中 是 否 有 受 体 的 存 在 。 利 用 -银 环 蛇 毒 素 从 电 鳐 属 电 辐 射 鱼 的 放 电 器 官 细 胞 质 膜 中 分 离 纯化 了 乙 酰 胆 碱 受 体 。 结 构 分 析 发 现 这 种 受 体 是 由 5 个 亚 基 组 成 的 ， 其 中 两 个 亚 基 、 一 个 亚 基 、 一 个 亚 基 、 一 个 亚 基 ， 最 小 的 亚 基 上 有 乙 酰 胆 碱 的 结 合 位 点 。 分 离 纯 化 了 乙 酰 胆 碱 受 体 ， 可 用 人

20、工 脂 质 体 研 究 其 功 能 。 实 验 发 现 将 纯 化 的 烟 碱 样 乙 酰 胆 碱 受 体加 到 脂 质 体 上 ， Na+的 通 透 性 就 增 加 了 ， 由 于 人 工 脂 质 体 上 没 有 其 它 的 蛋 白 成 分 ， 根 据 这 一 实 验 推测 烟 碱 样 乙 酰 胆 碱 受 体 本 身 就 是 一 种 Na+离 子 通 道 ， 也 说 明 乙 酰 胆 碱 受 体 是 神 经 递 质 门 控 离 子 通道 。 通 道 的 开 启 与 关 闭 受 神 经 递 质 乙 酰 胆 碱 的 调 节 (图 5E-1)。图 5E-1 乙 酰 胆 碱 离 子 通 道 偶 联 受

21、 体 的 结 构 域 功 能2. 请设计一个实验研究受体与配体结合的特异性.（答案） 答 :可 采 用 非 放 射 性 标 记 的 底 物 同 放 射 性 标 记 的 配 体 竞 争 受 体 的 结 合 位 点 的 方 法 。 原 理 是 :如 果 结 合 是 特 异 性 的 ,只 有 信 号 分 子 能 够 同 受 体 结 合 ,而 与 信 号 分 子 无 关 的 分 子 则 不 能 同 受 体 结合 。 例 如 ,放 射 性 标 记 的 胰 岛 素 与 受 体 的 结 合 不 会 受 胰 高 血 糖 素 或 ACTH(促 肾 上 腺 皮 质 激 素 )的 抑 制 ,但 是 能 够 被 非

22、放 射 性 标 记 的 胰 岛 素 或 胰 岛 素 衍 生 物 所 抑 制 (图 5E-2)。图 5E-2 证 明 激 素 与 受 体 结 合 特 异 性 的 实 验实 验 中 ,将 放 射 性 标 记 的 胰 岛 素 与 分 离 的 膜 一 起 温 育 ,同 时 加 入 各 种 不 同 浓 度 的 胰 高 血 糖 素 或ACTH。 与 胰 岛 素 无 关 的 激 素 不 会 与 放 射 性 标 记 的 胰 岛 素 竞 争 质 膜 受 体 。 通 过 检 测 放 射 性 即 可 证 明 。3. cAMP 是如何发现的? 科学家是如何证明腺苷酸环化酶在信号转导中的作用?（答案） 播放动画 答 :

23、 1957 年 Earl Sutherland 及 其 同 事 们 在 研 究 狗 肝 组 织 中 糖 原 是 如 何 断 裂 时 发 现 了cAMP， 这 是 代 谢 研 究 的 一 个 重 要 里 程 碑 。 Sutherland 和 他 的 同 事 们 利 用 离 体 系 统 研 究 激 素 的生 理 反 应 ,经 过 多 次 努 力 后 ,他 们 发 现 胰 高 血 糖 素 或 肾 上 腺 素 与 细 胞 一 起 温 育 能 够 激 活 磷 酸 化 酶 。 破碎 细 胞 并 经 离 心 分 离 后 ,分 别 收 集 颗 粒 和 溶 液 ,发 现 磷 酸 化 酶 只 存 在 于 上 清

24、液 中 ； 但 是 ,如 果 要对 激 素 作 出 应 答 ,颗 粒 是 必 不 可 少 的 。 后 来 的 实 验 表 明 ,对 激 素 的 应 答 至 少 涉 及 两 个 不 同 的 过 程 。如 果 分 离 肝 的 匀 浆 液 中 的 颗 粒 部 分 ,并 将 分 离 的 颗 粒 与 激 素 一 起 温 育 ,然 后 将 与 激 素 温 育 过 的 颗粒 添 加 到 上 清 液 中 ,发 现 有 某 种 物 质 的 产 生 ,这 种 物 质 能 够 激 活 磷 酸 化 酶 。Sutherland 鉴 定 了 从 膜 颗 粒 中 释 放 出 的 物 质 是 一 种 小 分 子 的 环 状

25、单 磷 酸 腺 苷 ,即 cAMP。由 于 cAMP 是 激 素 作 用 膜 受 体 后 释 放 出 来 的 ,并 且 能 激 活 磷 酸 化 酶 的 活 性 ,所 以 cAMP 被 称 为第 二 信 使 。虽 然 cAMP 是 第 一 信 使 作 用 于 膜 颗 粒 后 产 生 的 第 二 信 使 ,至 于 cAMP 是 如 何 产 生 的 却 有 几 种推 测 。 最 简 单 的 推 测 是 与 激 素 结 合 的 受 体 本 身 就 有 催 化 ATP 生 成 cAMP 的 能 力 ,即 cAMP 是受 体 催 化 的 。 如 此 解 释 ,就 同 G 蛋 白 和 腺 苷 酸 酸 环 化

26、 酶 毫 无 关 系 了 。 为 了 证 明 cAMP 的 产 生 与 第 一 信 使 及 G 蛋 白 偶 联 受 体 膜 机 器 的 三 个 成 员 密 切 相 关 ,科 学 家们 进 行 了 一 系 列 实 验 获 得 了 证 据 ， 证 明 它 们 是 独 立 的 三 个 成 员 ， 共 同 完 成 信 号 转 导 。Joseph Orly 和 Micheal Schramm 通 过 细 胞 融 合 实 验 首 先 证 明 了 受 体 与 腺 苷 酸 环 化 酶 是 不 同 的两 种 蛋 白 。 用 于 融 合 实 验 的 两 个 细 胞 中 一 个 是 带 有 肾 上 腺 激 素 受

27、体 但 缺 少 腺 苷 酸 环 化 酶 的 红 细 胞 ，另 一 个 是 带 有 腺 苷 酸 环 化 酶 但 缺 少 肾 上 腺 激 素 受 体 的 肿 瘤 细 胞 。 细 胞 融 合 以 后 ， 加 入 肾 上 腺 激 素 能够 产 生 cAMP， 而 在 未 融 合 的 细 胞 中 加 入 肾 上 腺 激 素 则 不 会 有 cAMP 的 产 生 (图 5E-3)。虽 然 证 明 了 激 素 受 体 和 腺 苷 酸 环 化 酶 是 两 个 独 立 的 成 员 ， 但 是 ， 同 受 体 结 合 的 激 素 又 是 如 何 激 活腺 苷 酸 环 化 酶 ? 最 早 是 通 过 一 种 称 为

28、 cyc突 变 的 肿 瘤 细 胞 系 发 现 GTP 能 够 增 强 激 素 对 腺 苷酸 环 化 酶 的 激 发 作 用 。 这 种 突 变 细 胞 具 有 正 常 的 腺 苷 酸 环 化 酶 和 肾 上 腺 激 素 受 体 ， 但 是 用 肾 上 腺 素处 理 不 能 促 进 cAMP 的 生 成 。 如 果 在 该 细 胞 培 养 基 中 加 入 从 正 常 细 胞 分 离 的 G 蛋 白 ,就 能 够恢 复 对 cAMP 合 成 的 激 发 作 用 。 由 于 这 种 G 蛋 白 能 促 进 (stimulating) cAMP 的 合 成 ， 故 称 之称 为 Gs。上 述 实 验

29、 结 果 令 人 信 服 地 证 明 该 系 统 中 三 个 成 员 的 存 在 和 各 自 独 立 的 作 用 。 图 5E-3 证 明 肾 上 腺 素 受 体 与 腺 苷 酸 环 化 酶 是 两 个 不 同 蛋 白 的 细 胞 融 合 实 验设计实验 6. 核糖体与核酶1. 如何证明 RNA 聚合酶进行 5S rRNA 基因转录时, 使用的是内部启动子?（答案） 播 放 动 画 答 :可 通 过 基 因 操 作 。 如 将 5S rRNA 基 因 的 5 侧 的 上 游 序 列 完 全 除 去 ， 检 测 转 录 情 况 , 然 后 再 切 去 5S rRNA 基 因 的 部 分 内 部

30、序 列 ,再 检 测 转 录 情 况 。 实 验 结 果 表 明 : 将 5S rRNA 基因 的 5 侧 的 上 游 序 列 完 全 除 去 并 不 影 响 5S rRNA 基 因 的 转 录 。 但 是 ， 如 果 将 5S rRNA 基因 内 部 缺 失 一 部 分 序 列 (从 50 位 到 80 位 缺 失 )， RNA 聚 合 酶 不 仅 不 能 转 录 这 段 DNA， 甚至 不 能 结 合 上 去 (图 6E-1)。 如 果 将 5S rRNA 基 因 的 内 部 启 动 子 序 列 插 入 到 基 因 组 的 其 它 部 位 ，会 使 插 入 的 部 位 形 成 一 个 新

31、的 转 录 起 点 。图 6E-1 RNA 聚 合 酶 转 录 5S rRNA 基 因 启 动 子 的 鉴 定将 图 中 5S rRNA 基 因 的 A 片 段 或 D 片 段 缺 失 都 不 影 响 RNA 聚 合 酶 的 转 录 ,但 是 将 B 片段 或 C 片 段 缺 失 ,都 会 影 响 RNA 聚 合 酶 的 转 录 。 表 明 5S rRNA 基 因 的 启 动 子 位 于 5S 基 因内 部 的 控 制 区 。2. 如何证明原核生物的 16S-23S-5S 三种 rRNA 位于同一条转录的 rRNA 分子中.（答案） 答 :通 过 核 酸 酶 (RNase )突 变 体 的 研

32、 究 证 明 原 核 生 物 的 三 种 rRNA 位 于 同 一 个 原 初 转 录 物中 。 在 这 种 突 变 体 中 ， 三 种 rRNA 位 于 同 一 条 rRNA 分 子 中 ， 但 是 在 正 常 的 细 胞 中 这 三 种rRNA 是 以 三 种 独 立 的 小 分 子 存 在 ， 这 一 研 究 结 果 也 说 明 RNase 是 将 16S-23S-5S rRNA 前体 切 割 成 单 体 的 主 要 核 酸 酶 。 在 细 菌 中 RNase 不 是 参 与 rRNA 前 体 加 工 的 惟 一 的 一 种 酶 ， 还 需 要 其 它 一 些 核 酸 酶 参 与 ， 实

33、验 证 明 如 果 缺 少 其 它 一 些 酶 ， 得 不 到 正 确 大 小 的 rRNA。设计实验 7. 线粒体与过氧化物酶体1. 请根据线粒体外膜比内膜通透性高这一特性,设计分离线粒体各组份的方法（答案） 答 : 将 线 粒 体 放 在 低 渗 溶 液 或 者 去 垢 剂 毛 地 黄 皂 苷 (digitonin)中 直 到 线 粒 体 外 膜 裂 开 ， 随 着外 膜 的 破 裂 ,膜 间 隙 中 的 物 质 释 放 到 溶 液 中 , 此 时 线 粒 体 内 膜 和 基 质 仍 结 合 在 一 起 (称 为 线 粒体 质 ),通 过 离 心 可 将 线 粒 体 质 分 离 。 用 去

34、 垢 剂 Lubrol 进 一 步 处 理 线 粒 体 质 ， 破 坏 线 粒 体 内 膜 ,释放 线 粒 体 基 质 , 破 裂 的 内 膜 重 新 闭 合 形 成 小 泡 ,其 表 面 有 F1 颗 粒 。 实 验 中 要 通 过 离 心 分 离 各 组 分 , 并 要 借 助 电 子 显 微 镜 观 察 将 内 膜 和 外 膜 区 分 开 来 分 离的 外 膜 看 起 来 象 空 的 囊 ， 而 内 膜 会 形 成 小 泡 ， 内 膜 自 我 封 闭 形 成 内 膜 小 泡 的 外 表 面 含 有 F1颗 粒 。2. 请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体（答案） 答 : 可

35、通 过 基 因 工 程 和 分 子 生 物 学 方 法 进 行 研 究 ， 主 要 过 程 如 下 ： 克 隆 线 粒 体 基 质 蛋 白 基 因 ; 在 无 细 胞 系 统 中 合 成 酵 母 线 粒 体 蛋 白 ; 检 测 分 离 后 将 合 成 的 蛋 白 质 分 成 两 组 ,一 组 直 接 加 入 胰 蛋 白 酶 ,另 一 组 先 加 入 线 粒 体 ,然后 再 用 胰 蛋 白 酶 蛋 白 酶 处 理 ; 结 果 分 析 : 如 果 加 入 线 粒 体 的 一 组 中 的 蛋 白 质 对 胰 蛋 白 酶 具 有 抗 性 ,而 不 加 线 粒 体 的 一 组中 蛋 白 质 被 胰 蛋

36、白 酶 水 解 , 即 可 证 明 加 入 线 粒 体 后 , 线 粒 体 蛋 白 进 入 了 线 粒 体 。 因 为 胰 蛋 白 酶是 水 溶 性 的 酶 ,不 能 进 入 线 粒 体 ,所 以 对 胰 蛋 白 酶 的 抗 性 说 明 线 粒 体 蛋 白 进 入 了 线 粒 体 从 而 得 到 保护 。实 验 过 程 示 于 图 7E-1。图 7E-1 线 粒 体 蛋 白 前 体 转 运 的 实 验 证 明3. 科学家是怎样证明线粒体基质蛋白在转运过程中穿膜中间体的存在？如何证明导序列(导肽) 没有特异性? （答案）答 : 主 要 是 通 过 离 体 实 证 实 了 穿 膜 中 间 体 的

37、存 在 ,并 证 明 导 向 序 列 对 所 引 导 的 蛋 白 质 没 有 特 异性 (图 7E-2)。首 先 利 用 DNA 重 组 技 术 构 建 一 个 嵌 合 蛋 白 ， 其 N-端 含 有 一 个 长 为 31 个 氨 基 酸 的 线 粒 体基 质 导 向 序 列 ,其 后 接 上 一 段 间 隔 序 列 ,长 度 为 51 个 氨 基 酸 ,紧 接 着 是 187 个 氨 基 酸 组 成 的 小 鼠二 氢 叶 酸 还 原 酶 (DHFR),该 酶 在 正 常 情 况 下 存 在 于 胞 质 溶 胶 中 ,并 且 它 的 C-末 端 可 在 分 子 伴 娘的 作 用 下 处 于 非

38、 折 叠 状 态 。 用 无 细 胞 系 统 合 成 的 DHFR 嵌 合 蛋 白 能 够 被 转 运 到 线 粒 体 基 质 ,然 后 切 除 导 向 序 列 。 氨 甲 蝶 呤 (methotrexate)是 DHFR 抑 制 剂 ,它 能 够 与 嵌 合 的 DHFR 的 活 性位 点 牢 牢 地 结 合 ,使 嵌 合 DHFR 锁 定 在 折 叠 状 态 而 不 能 进 入 线 粒 体 基 质 。 但 是 N-端 的 导 向 序列 能 够 进 入 线 粒 体 基 质 ,并 被 水 解 ,此 时 的 DHFR 仍 然 被 结 合 在 膜 上 形 成 稳 定 的 转 运 中 间 体 。 这

39、 一实 验 中 ,间 隔 序 列 的 设 计 非 常 重 要 ,如 果 间 隔 序 列 较 短 ,譬 如 说 35 个 氨 基 酸 ,就 得 不 到 稳 定 的 转 运中 间 体 。 当 除 去 氨 甲 蝶 呤 ,嵌 合 DHFR 就 能 完 全 进 入 线 粒 体 基 质 。这 一 实 验 同 时 证 明 了 导 肽 没 有 特 异 性 。图 7E-2 线 粒 体 蛋 白 转 运 中 间 体 的 证 明(a)通 过 重 组 DNA 技 术 构 建 的 嵌 合 蛋 白 的 结 构 。 (b)转 运 中 间 体 的 证 明 。 氨 甲 蝶 呤 是DHFR 的 抑 制 剂 ,它 能 够 同 DHF

40、R 的 活 性 位 点 结 合 ,使 DHFR 不 能 解 折 叠 ,因 而 不 能 穿 过 运 输 通 道 ,维 持 转 运 中 间 体 的 状 态 ,这 种 状 态 能 够 通 过 电 子 显 微 镜 进 行 观 察 。 当 除 去 氨 甲 喋 呤 ,转 运 中 间体 消 失 ,因 为 DHFR 能 够 解 折 叠 ,从 而 进 入 线 粒 体 基 质 。4. 请设计一个实验证明 ATPase 既能催化 ATP 的水解,又能催化 ATP 的合成（答案） 播 放 动 画 答 : 可 采 用 来 自 其 它 膜 结 构 中 的 ATPase 作 实 验 , 如 用 质 膜 中 的 Na+/K+

41、 ATPase。 在 细 胞质 膜 中 ,该 酶 的 功 能 是 水 解 ATP 进 行 K+的 逆 浓 度 梯 度 运 输 ,这 是 该 酶 在 细 胞 质 膜 中 的 惟 一 功 能 。实 验 采 用 红 细 胞 。 首 先 分 离 红 细 胞 并 在 高 K+离 子 水 溶 液 中 制 成 血 影 ,使 其 内 部 具 有 极 高K+离 子 浓 度 ， 然 后 将 之 放 入 具 有 极 高 浓 度 的 Na+离 子 环 境 中 ,“细 胞 ”内 的 K+向 外 移 动 ,而 Na+向 细 胞 内 移 动 。 这 两 种 离 子 都 是 沿 各 自 的 浓 度 梯 度 向 下 移 动 ,

42、而 不 像 在 生 活 细 胞 中 那 样 逆 浓 度梯 度 移 动 。 如 果 在 红 细 胞 血 影 中 加 入 ADP 和 Pi 的 话 ,离 子 的 移 动 会 引 起 ATP 的 合 成 而 非ATP 的 水 解 (图 7E-3)。图 7E-3 利 用 红 细 胞 血 影 和 Na+/K+ ATPase 重 组 小 泡 进 行 的 ATP 合 成 实 验图 中 小 写 字 母 表 示 离 子 移 动 的 方 向 。上 述 实 验 结 果 表 明 ,在 科 学 研 究 中 ， 不 能 总 是 按 常 规 思 维 去 认 识 事 物 ， 反 向 理 论 也 有 很 重 要 的 作用 。

43、上 述 结 果 是 根 据 酶 催 化 反 应 的 反 向 理 论 去 认 识 酶 的 作 用 后 发 现 的 ,同 时 ,该 实 验 也 证 明 了 离子 梯 度 能 够 驱 使 ADP 磷 酸 化 合 成 ATP。 可 以 用 这 一 结 果 预 测 在 线 粒 体 膜 间 隙 中 由 电 子 传 递 所 建立 的 质 子 移 动 力 可 用 于 ATP 的 合 成 。 实 验 中 合 成 ATP 必 须 满 足 三 个 条 件 :要 有 膜 结 合 的ATP 合 酶 、 离 子 梯 度 、 合 成 ATP 的 化 学 材 料 (ADP 和 Pi),这 三 个 条 件 在 线 粒 体 内

44、膜 的 两 侧 都 是具 备 的 。5. 请推测线粒体膜重建实验是如何进行的?（答案） 答 : 为 了 证 明 F1 具 有 ATP 合 酶 的 作 用 , 最 好 、 最 直 接 的 方 法 是 通 过 线 粒 体 膜 的 重 建 实 验 ,验 证 其 功 能 , 即 将 线 粒 体 内 膜 与 其 嵴 上 的 F1 颗 粒 分 离 出 来 ,重 新 装 配 后 研 究 F1 的 功 能 。 实 验 中 先 分 离 附 着 有 F1 颗 粒 的 线 粒 体 内 膜 小 泡 ,然 后 将 小 泡 置 于 加 有 NADH、 ADP 和 无机 磷 的 溶 液 中 ,这 些 小 泡 能 够 将 N

45、ADH 的 电 子 经 由 小 泡 膜 中 呼 吸 链 逐 步 传 递 给 O2,偶 联 合 成 了ATP。Efraim Racker 实 验 室 第 一 个 成 功 进 行 了 含 有 F1 颗 粒 的 线 粒 体 内 膜 小 泡 的 拆 装 。 首 先 分 离 完整 的 线 粒 体 ， 然 后 用 超 声 波 处 理 使 线 粒 体 破 裂 。 破 裂 的 线 粒 体 内 膜 能 够 自 我 封 闭 成 内 膜 小 泡 ,其 上 结合 有 F1 颗 粒 ， 然 后 用 脲 处 理 或 用 玻 珠 与 内 膜 小 泡 一 起 振 荡 ， 使 内 膜 上 附 着 的 F1 颗 粒 脱 落 ，形

46、 成 没 有 颗 粒 附 着 的 内 膜 小 泡 ， 将 处 理 的 样 品 离 心 后 ,分 别 收 集 沉 淀 和 上 清 液 。 在 显 微 镜 下 检 查收 集 的 沉 淀 都 是 表 面 光 滑 的 小 泡 。 经 功 能 实 验 ， 这 种 光 滑 型 的 内 膜 小 泡 只 有 电 子 传 递 的 功 能 而 没 有合 成 ATP 的 能 力 。 实 验 收 集 的 上 清 液 中 含 有 从 内 膜 脱 落 的 F1 颗 粒 ,经 检 查 ,这 种 颗 粒 既 不 能 传递 电 子 又 不 能 合 成 ATP。 非 但 如 此 ,分 离 的 F1 颗 粒 能 够 水 解 ATP

47、,其 功 能 与 结 合 在 线 粒 体 内 膜 时相 反 。 根 据 这 一 结 果 推 测 ,F1 的 正 常 功 能 是 附 着 在 线 粒 体 内 膜 上 进 行 ATP 的 合 成 ,若 是 脱 离 了内 膜 则 具 有 水 解 ATP 的 作 用 ,因 为 失 去 了 合 成 ATP 所 需 要 的 能 量 。这 种 假 说 得 到 实 验 的 支 持 。 将 分 离 的 F1 颗 粒 与 光 滑 的 线 粒 体 内 膜 小 泡 结 合 ,使 F1 颗 粒 重新 附 着 到 线 粒 体 内 膜 上 ,这 种 重 建 的 含 有 F1 颗 粒 的 线 粒 体 小 泡 不 仅 能 够

48、进 行 电 子 传 递 ,而 且 具有 ATP 合 成 的 能 力 (图 7E-4)。 通 过 线 粒 体 内 膜 重 建 实 验 ,人 们 得 出 结 论 线 粒 体 内 膜 中 的 F1颗 粒 是 一 种 ATP 合 酶 ， 它 是 呼 吸 链 上 氧 化 (放 能 )和 磷 酸 化 (贮 能 )的 偶 联 装 置 。图 7E-4 线 粒 体 内 膜 重 建 实 验6. 请推测 David Luck 通过什么样的实验证明线粒体是通过分裂增殖的?实验过程如何? （答案） 答 : 1965 年 David Luck 通 过 放 射 性 标 记 实 验 证 明 线 粒 体 分 裂 增 殖 的 观

49、 点 。 首 先 将 脉 胞 菌 (胆 碱 缺 陷 突 变 株 )培 养 在 加 有 3H 标 记 的 胆 碱 (一 种 磷 脂 的 前 体 物 )培 养 基 中 ,使 线 粒 体 的 膜 带 上 放 射 性 标 记 。 然 后 收 集 放 射 性 标 记 的 细 胞 ,转 入 非 同 位 素 的 培 养 基 中 继 续 培养 ,分 别 在 不 同 培 养 时 间 收 集 菌 体 ,再 通 过 放 射 自 显 影 检 查 经 过 不 同 时 期 培 养 的 细 胞 中 同 位 素 的 分布 。 并 预 测 同 位 素 的 分 布 应 是 下 述 三 种 模 式 中 的 一 种 : 如 果 新 的 线 粒 体 是 由 已 有 线 粒 体 的 生 长和 分 裂 而 来 ,那 么 每 分 裂 一 次 ,线 粒 体 中 的 放 射 性 就 会 减 少 一 半 ； 如 果 新 的 线 粒 体 是 重 新 合 成的 ,那 么 ,新 线 粒 体 应 该 没 有 放 射 性 ,而 老 的 线 粒 体 的 放 射 性 应 与 原 初 的 线 粒 体 相 同 ； 如 果 新线 粒 体 是 由 其 他 的 膜 重 新 装 配 而 来 ,那