1、对兔血红细胞细胞融合条件的探究陈康、郭晓斌、刘鹏键（华南师范大学生命科学学院, 广东 广州 510631）摘要：本实验旨在探究兔血红细胞细胞融合所需的条件，希望为实验教学提供可靠的数据。关键词：兔血红细胞、细胞融合、PEG1、前言所谓细胞融合(cell fusion)就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，
2、使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视引。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。 12 理论、方法、研究内容2.1原理：细胞融合(
3、cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。 人工诱导细胞融合始于20世纪50年代，并迅速成为一门新兴技术, 发展非常快, 应用范围也极为广泛,。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域。细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单克隆抗体的制备, 核质关系, 体细胞的遗传和发育, 新品种的培养, 免疫作用
4、, 疾病的治疗和性状的改良, 潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。目前, 诱导细胞融合的方法有多种，其中PEG(聚乙二醇 ) 法为一种规范的重要的化学融台法，PEG法诱导产生杂交细胞的频率高。 【2】聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相对分子质量为200-6000均可用作细胞融合剂。利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两
5、细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞间发生融合。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞) 不适用2.2方法、研究内容：利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响。 1. PEG的分子量与浓度2. PEG的pH值。3. PEG的处理时间: 4. 融合时的温度。本实验保持 PEG的pH值8.08.2，PEG的处理时间12min ，浓度为50PEG对细胞融合的影响， 研究不同融合温度20-40细胞融合率的变化，从而测得最适融合温度x。保持 PEG的pH值8.08.2，
6、PEG的处理时间为最适融合温度x，浓度为50PEG 对细胞融合的影响， 研究不同融合时间5-25min 细胞融合率的变化，从而测得最适融合时间ymin。本实验所用材料为兔子的血细胞，这是因为: 1.易于采集标本，实验材料便宜2采集后放置于冰箱中一周，不影响融合效果 3 试剂、仪器：3.1 试剂：(1)Alsver 液：葡萄糖 2.05 g，柠檬酸钠 0.8 g，氯化钠 0.42 g，用柠檬酸溶液调节 pH 值至 7.2,最后用重蒸水定容至 100 mL 即可。 (抗凝血试剂的种类和作用简介) (2)0.85生理盐水： 0.85g 氯化钠溶于 100mL 重蒸水中。 (3)GKN 液：氯化钠 8
7、 g，氯化钾 0.4 g， 磷酸氢二钠 1.77g，磷酸二氢钠0.69g，葡萄糖 2 g，酚红 0.01 g，溶于 1000mL 重蒸水中。 (4)Ringer 溶液：氯化钙 0.25g，氯化钾 0.42g，氯化钠 6.5g(恒温动物 8.5g)溶于1000mL 蒸馏水中。 (5)氯化钙 0.14g ,氯化钾 0.4g , 磷酸二氢钾 0.06g ,氯化镁 0.10g , 氯化钠 8.0g ,碳酸氢钠 0.35g , 七水磷酸氢二钠 0.09g ,D-葡萄糖 1.0g,酚红 0.01g(6)50PEG 混合液：称取少许 PEG(Mw 2000/3000/4000/5000/6000)放人刻度离
8、心管内，在沸水浴中加热， 使其溶化，待冷却至 50时，加入预热至 50 的等体积的 GKN 液，混匀，配成 50PEG，置 37cc 水浴箱内保温。注意使用前配制。3.2 仪器：显微镜，离心机，水浴箱，电炉， 量筒，离心管，注射器，试管，移液管，烧杯， 吸管，载玻片，盖玻片，显微镜。4 实验步骤4.1.细胞悬液的制备： 兔血红细胞悬液的制备：用注射器吸入 1mL Alsver 液后，从兔子去毛的耳缘取血 1mL 放入刻度试管中，再加入 2mLAlsver 液(封口 后可 4冰箱内可保存1 周)；放入刻度离心 管内，按照 3：1(VV)加入 6mL Alsver 液混匀，放入4冰箱内可保存 3-
9、4 天。4.2.取 10mL 离心管 5 支，贴好标签，各移入细胞悬液 1mL， 加入 4mL0.85生理盐水混匀。1500r min 离心 5 min。 4.3 弃上清液(用吸管吸去)，加 0.85生理盐水至 5mL，混匀后 1500rmin 离心 5min。 4.4 重复上述条件，再离心洗涤 1 次。 4.5 收集最后 1 次离心沉淀的血细胞，加入 适量的 GKN 液或 Ringer 溶液，按压积红细胞体积配成 10的红细胞悬液。 4.6 取各个悬液各 1mL 到另外 5 个试管中，分别加入 0.50.8 mL 预热的 50各分子量的 PEG 混匀，置于 37水浴中温浴 2min； 再加入
10、 Ringer 或 Hanks液 5ml 以终止 PEG 的作用;取血细胞悬液 1 滴滴于载玻片上，再加入 0.2%次甲基蓝溶液 1 滴,盖上盖玻片。4.7 观察方法：发生融合的细胞比未发生融合的细胞大两倍以上 35 结果分析5.1 结果观察取细胞悬液利用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察 2 个靠近细胞或 3 个细胞形成融合的过程，并计算融合率。5.2 结果计算融合率的计算方法为：随机计数显微镜几个视野内 1000 个细胞，分别计数其中已发生融合的细胞、未融合细胞数、计算融合细胞核数占细胞核总数之百分比即融合率一其公式如下：融合率= 融合细胞数 100总细胞数6 预期的实 验 结 果 经 PEG 处理后，在显微镜下，可观察到未融合的细胞、融合细胞（较大是未融合细胞的两倍以上） 。多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。参考文献：1王克明.细胞融合技术及其进展.浙江科技学院学报第 16 卷第 2 期，2004 年 6 月2 彭勇宜. 鱼类细胞融合J. 益阳师专学报 , 2002,(03)3 李玲、李雪峰 细胞生物学实验 湖南科学技术出版社 2003.08
