1、微生物检查体系的调整,微生物检测环境变化,控制菌项目变化,非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法,通用要求要点：(1) 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指导原则(2) 环境洁净度应符合要求。定期检测：不低于B级的单向流空气区域、工作台面、环境。参考USP1117实验室分区原则。(3) 前处理：供试品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面活性剂的无毒性及与相容性。(4) 方法选择：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。（平
2、皿法、薄膜过滤法和MPN法）(5) 菌种管理：（9203）药品微生物实验室质量管理指导原则关于菌株管理的要求。(6) 阴性对照：微生物检查需进行阴性对照试验。如果对照有菌生长，应进行偏差调查。,试验菌,微生物计数用培养基,培养基适用性检查,培养基适用性检查,计数方法适用性试验,2、接种和稀释,接种和稀释,消除供试品的抑菌活性的方法（1）增加稀释剂和培养基的用量；（2）加入中和剂或灭活剂；（3）采用薄膜过滤法和冲洗；（4）综合上述措施。 根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法适用性试验。若方法适用性试验符合要
3、求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检测。,培养条件,结果判断,供试品检查部分 1、操作,供试品检查部分 2、培养,供试品检查部分-结果判断,供试品检查部分-结果判断,供试品检查部分-计数标准,非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法,通用要求要点：(1)控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测法，但必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。（9201）药品微生物检验替代方法验证指导原则。(2)供试液制备及实验环境要求同非无菌产品微生物检查：微生物计数法参考USP1117实验室分区原则。(3)前处理：供试
4、品的抗菌活性，中和剂和灭活剂的有效性及无毒性。表面活性剂的无毒性及与相容性。(4)在各控制菌项下：生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验。”改为较少的生化实验或“采用其它适宜方法进一步鉴定。”,控制菌结果判断趋向多样化, 控制菌检查中将原来大肠菌群的检测改为耐胆盐的革兰氏阴性菌，另外培养基体系也有较明显的变化，较少的生化实验或采用其它适宜方法进一步鉴定（镜检、生化、色谱光谱技术、分子生物学等）,供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌,大肠菌群的定义是指在37生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或兼性厌氧的无芽孢杆菌。它不是分类学上的名称。符合上述定义的菌除埃希菌属外，
5、还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。,供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌,取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则1105）制成1:10供试液，混匀，在2025 培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但不繁殖（约2小时）。取相当于1g或1ml供试品的上述预培养物接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培养基中，3035 培养2448小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，3035 培养1824小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。1:10TSB供试液（20-25 2h）肠道增菌肉汤 紫红胆盐
6、葡萄糖琼脂（大肠、铜绿+/金葡-） （大肠、铜绿+指示）24-48h 18-24h,供试品检查部分-耐胆盐革兰阴性菌,选择和分离培养 取相当于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供试品的预培养物或其稀释液分别接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道增菌液体培养基中，3035培养2448h。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，3035 培养1824h。结果判断 若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，从表二查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。表2 耐
7、胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N）- 各供试品量的检查结果 -每1g（或1ml）供试品种可能的菌数cfu 0.1g或0.1ml 0.01g或 0.001g或 - + + + N 103 + + - 102 N 103 + - - 10N102 - - - N 10 -,供试品检查部分-大肠埃希菌,大肠埃希菌室肠杆菌科埃希菌属的代表种大肠埃希菌室两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，格兰阴性。无芽孢，多鞭毛，培养最适温度为37 ，可在1546 生长，兼性厌氧。 取1:10供试液至tsb（适宜体积）（18-24h） MaC肉汤 MaC琼脂 （大肠+/金葡-） （大肠+指示） 42-44 24-48h 18
8、-72h结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。,供试品检查部分-沙门菌,沙门菌为革兰阴性菌，无芽孢，菌体通常（0.40.9）um（13）um，两端钝圆。需氧或兼性厌氧，1042皆可生长，最适温度37 . 加入10g供试品的TSB供试液（18-24h) RV肉汤 XLD琼脂 （沙门+/金葡-) (沙门+/金葡-） 18-24h 18-48h结果判断 若木糖赖氨酸脱氧但酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底面
9、为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。若果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色黑色，判供试品未检出沙门菌。,非无菌产品微生物限度检查：非无菌药品微生物限度标准,表1 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准,非无菌产品微生物限度检查：非无菌药品微生物限度标准,表2 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准,非无菌产品微生物限度检查：非无菌药品微生物限度标准,表3 非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（新增）表4 中药提取物及中药饮片的
10、微生物限度标准（新增）,非无菌药品微生物限度标准,限度标准由“数量”向“数量级”转变 非无菌药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则1105）检查；非无菌药品的控制菌照“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”（通则1106）检查。各品种项下规定的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数标准解释如下： 101 cfu: 可接受的最大菌数为20; 102 cfu: 可接受的最大菌数为200; 103 cfu: 可接受的最大菌数为2000:以此类推。 虽然扩大了限度的标准，但是对过程控制的要求有了很大的提高，培养基的营养能力也有了很多的提高，未来将向参数放行方向发展
11、。,1101 无菌检查法-培养基,硫乙醇盐酸流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。,培养基体系与国际接轨，改变以往微生物分类培养的错误，正确考虑培养基的广谱性。否定了检查中对微生物分类培养的概念，即某种污染了需氧菌的供试品，无论被接种在TSB中，均可被检出，不容易漏检。,1101 无菌检查法-培养基的适用性检查,本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。1、无菌性检查 每批培养基随机取不少于五支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。2、灵敏度检查-培养基灵敏度检查所用菌株传代次数不得超过5代。,将枯草芽孢杆
12、菌移到TSB灵敏度检查中，能够确保在两种培养基中需气菌都能够生长,1101 无菌检查法-培养基灵敏度检查,12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天。9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。对照管无菌生长，若加菌的培养基管生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。,1101 无菌检查法-方法适用性试验,药典规定 进行产品无菌检查时，应进行方法适用性检验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。 若检
13、验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。,选用菌株的原则 代表性 普遍性 低或非致病性 标准菌株（或药品中常见的污染菌）试验方法：薄膜过滤法和直接接种法。可与供试品的无菌检查同时进行。,1101 无菌检查法-供试品无菌检查,无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品允许，应采用薄膜过滤法。供试品检查方法应与方法适用性确认的方法相同。若是表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。 检验数量及检验量,表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量,1101 无菌检查法-检验量,表1：针对注册性质 表2、针对委托、进口、国评等性质 具
14、体检验量要看检品的装量来综合三个表：如果是注册的则看表1和表3，若果是其他的则看表2和表3例1：注射用头孢呋辛钠，规格0.25g，注册查表1得 批产量：500，接种每种培养基所需的最少检验数量：2或20个（取较少者，目前我们都是取20个）查表3得 每支供试品接入每种培养基的最少量：半量（即一瓶样品可以对半接种至每种培养基）综上述得：取30瓶样品，分三份接种至每种培养基里面。例2：注射用宫缩素，规格10单位，注册查表1得 批产量：500，接种每种培养基所需的最少检验数量：2或20个（取较少者，目前我们都是取20个）查表3得 每支供试品接入每种培养基的最少量：全量综上述得：取60瓶样品，分三份接种
15、至每种培养基里面。例3： 左卡尼汀注射液，规格5ml：1g左卡尼汀，进口查表2得 供试品最少检查数量（瓶或支）：10支查表3得 每支供试品接入每种培养基的最少量：半量综上述得：取15支样品，分三份接种至每种培养基里面。,1101 无菌检查法-供试品无菌检查,阳性对照试验无抑制作用的供试品以金色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阳性为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阴性对照试验 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。,1101 无
16、菌检查法-供试品无菌检查-薄膜过滤法,操作方法:将规定量的供试品溶液按薄膜过滤法过滤，冲洗（按适应性试验确认的方法）。将培养基加至滤筒内检查要点：采用封闭式包，薄膜过滤器。滤膜孔径应不大于0.45um。根据供试品特性选择滤膜材质。滤过过程保持液面覆盖整张膜。每膜总冲洗量不得过1000ml。,1101 无菌检查法-供试品无菌检查-培养及观察,1101 无菌检查法-结果判断,阳性对照管应生长良好，阴性随着管无菌生长。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。试验结果无效: (1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法要求。（2）回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证室因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。判试验结果无效：重测判实验结果不合格：应通过系统风险评估，并有相应的记录。,O(_)O谢谢大家！,
