1、国外学者发现胸苷酸合成酶 (TS)是 5-FU 产生耐药的一个重要酶，癌组织中 TS 的表达水平可以用于指导治疗并与患者的预后相关，TS 高表达患者对 5-FU 的敏感性明显高于低表达者，TS 低表达容易对 5-FU 产生耐药性。胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，TP)、胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS) 和二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD) 是细胞核酸代谢过程中起重要作用的三个酶，并且以不同的角度与 5-FU 相互作用而影响 5-FU 的疗效。TP 可逆性地催化胸腺嘧啶核苷转变为 2
2、-脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶，即通过催化胸苷和胸腺嘧啶的相互转化而稳定细胞内胸苷的水平。进入体内的 5-FU 需经过 TP 的作用被活化后才具有抗癌作用，TP 还具有血管生成活性，与 PD-ECGF 是同一基因的转录产物。TS 是合成胸苷酸的限速酶，催化 dUMP 转化为 dTMP，而 dTMP 是 DNA 合成和修复所必须的胸腺嘧啶核苷酸的唯一来源，所以 TS 在细胞增生过程中发挥重要作用。 TS 也被证明是 5-FU 作用的靶向酶，5-FU 就是通过抑制 TS 活性阻断 DNA 合成而发挥抗肿瘤的作用。DPD 是尿嘧啶和胸腺嘧啶分解过程中的第一限速酶，可降低用于 DNA 合成的尿嘧啶和胸
3、腺嘧啶的水平而影响 DNA 的合成。DPD 同时也是降解 5-Fu 的最主要的限速酶，体内 5 一 FU 用量的 85%由此酶降解。.胸苷酸合成酶对结肠癌 5Fu 化疗耐药影响的前瞻性研究【摘要】 目的 探讨结肠癌对 5Fu 产生耐药的机理,从细胞培养水平上进一步论证胸苷酸合成酶对 5Fu 化疗产生耐药的影响。方法 应用 MTT 法对体外培养的 30 例结肠癌细胞进行 5Fu 药敏试验，再应用 SP 免疫组化法对 30 例结肠癌进行胸苷酸合成酶检测，然后将两个结果进行比较。结果 胸苷酸合成酶高表达组体外培养的结肠癌细胞对 5Fu 的敏感性明显低于 TS 低表达组。结论 胸苷酸合成酶表达程度的高
4、低对临床结肠癌患者化疗药物的选择有一定的指导意义。 【关键词】 结肠癌;MTT; 免疫组织化学 ;胸苷酸合成酶（ TS）;5Fu; 细胞培养The Influence of Thymidylate Synthase (TS) in Colon Carcinoma used 5Fu Cure Prospective StudyCHEN Xin, LIN Wenbo, SHEN YouzhuDepartment of Pathology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China;Nanan Hospital of Fujian Province；
5、1st Hospital of Zhaoan cityAbstract：Objective To investigate the reason of the 5Fu drug resistance, and to prove deeply the influence of TS in colon carcinoma with the level of cell culture.Methods To proceed the 5Fu drug susceptibility test with MTT method to 30 cases in vitro culture colon carcino
6、ma cell; to be examined by SP immunohistochemical staining and observed the expression of TS; and then compare with them.Results In vitro culture colon carcinoma cells corresponding highexpression of TS the senility to 5Fu delay obviously than the lowexpression.Conclusion The positive expression of
7、TS has a instruction significance in colon carcinoma patients at the election of chemistry drug.Key words：Colon carcinoma;MTT；Immunohistochemical;Thymidylate synthase (TS); 5Fu; Cellculture0 引言5Fu 广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切一直处于其他化疗药无法替代的地位，目前仍是肠道恶性肿瘤的首选化疗药。但一些结肠癌病例对 5Fu 为主的化疗并不敏感，为提高对 5Fu 原发性和继发性耐药患者的
8、治疗效果，有必要从细胞水平上阐明 5Fu 耐药机制，找出能用于评价 5Fu 化疗敏感性的指标。1 材料与方法1.1 材料 选取我院术前未进行 5Fu 化疗的结肠癌新鲜标本 30 例，其中男性 21 例，女性 9 例，再将所有结肠癌根治术标本经 10福尔马林液固定，石蜡包埋。1.2 试剂 RPMI1640 培养基干粉，胎牛血清,MTT，透明质酸酶胰蛋白酶， 型胶元蛋白酶，DNA 酶，220nm 薄膜滤菌器，以上试剂均来自华美生物工程公司北京分公司。绵羊抗人 TS 蛋白单克隆抗体， AP 标记的兔抗绵羊二抗（美国 Rockland 公司），生物素代兔抗绵羊二抗（美国 K.P.L 公司）。SP 试剂
9、盒，DAB 显色试剂盒（福州迈新公司）。1.3 方法1.3.1 肿瘤细胞培养 无菌条件下取手术根治切除的结肠癌组织，置于合有 500U/ml青霉素，500g ml 链霉素清洗（10min ）, 将肿瘤组织剪成 1mm3 碎块后，置于含有型胶元蛋白酶（200U/g）型 DNA 酶（100U/g），型透明质酸酶（1 500U/g）的RPMI1640 培养基（4，20h）,离心（1 000r/min，5min ）两次，收集单个细胞用RPMI1640 液将细胞洗两遍后，以 5105 个ml 活细胞数接种于培养瓶中，加入 20胎牛血清（FBS ），置于 CO2 培养箱中（37，5CO2），次日培养细胞贴
10、壁，3 天更换一次生长液，计算肿瘤细胞群体增倍时间（36h），不用传代，直接用原代细胞进行实验。将细胞悬液浓度为 2104ml 加入 96 孔培养板中，每孔 200l，置于二氧化碳培养箱中（37，5CO2，2h）；在 96 孔板中加入 5Fu（150gml），每孔 20l，置于二氧化碳培养箱中（37，5CO2，36h ）；吸弃上清每孔加入 MTT 应用液（5mg/ml）20l，培养 4h 后，每孔再加 200l 的酸化异丙醇终止反应，以上步骤均严格遵循无菌操作原则，最后用酶标仪测定每孔及光度值（测定波长 540nm），以未加 5Fu 进行药敏的癌细胞为对照组。1.3.2 免疫组化染色 采用 S
11、P 法进行免疫组化染色；将 30 例结肠癌石蜡切片脱蜡至水，无须抗原修复，直接浸入 3H2O2 内源性酶处理 10min，PBS 洗 35min；10 正常羊血清封闭 10min，PBS 洗 35min；加一抗（绵羊抗人 TS 蛋白单克隆抗体 1300稀释）1h，PBS 洗 35min；加生物素标记的二抗（兔抗绵羊 1400 稀释）10min，PBS洗 35min；加 SP 溶液，10min ，PBS 洗 35min； DAB 显色，苏木素复蓝，中性树胶封片。1.3.3 结果判断 TS 蛋白表达阳性区域在细胞浆中出现棕黄色的阳性颗粒。随机选取4 个中倍视野（1010 ），计算 400 个细胞浆
12、中阳性细胞的百分数，当阳性细胞数目75为（+）。计算每例结肠癌细胞体外培养的 5Fu 药敏试验的抑制率（）：抑制率（）=（1- 试验孔 OD540对照孔 OD540）1002 结果30 例结肠癌组织 TS 蛋白表达均为阳性，根据肿瘤细胞阳性数分为两组：高表达组（+），低表达组（+ +），见表 1。表 1 TS 蛋白高表达组与低表达组比较（略）表 2 TS 表达与体外培养的癌细胞 5Fu 抑制率的关系（略）从表 2 可以看出 TS 高表达组的体外培养癌细胞 5Fu 抑制率明显低于低表达组，差别具有统计上的意义（P0.05）。3 讨论 5Fu 广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切，一直
13、处于其他化疗药无法替代的地位，但一些结肠癌病例对 5Fu 为主的化疗并不敏感，其对 5Fu 单药治疗的有效率仅 203，本文想通过体外细胞培养，从活细胞水平上论证胸苷酸合成酶对结肠癌 5Fu 化疗耐药的影响。MTT 法的原理是以黄色的四氮唑盐可被活细胞线粒体中的与辅酶 NADP 相关的脱氢酶过厚，即接受氢原子而成为不溶性的甲铒替颗粒，而死细胞无此功能，无甲铒替颗粒形成，因此用酶标仪测定的 OD540 值越高，说明肿瘤细胞的耐药性越强，药物抑制率越低。胸苷酸合成酶（TS）是由两个相同亚单位组成的 聚体蛋白质，每个亚单位的分子量为 36Kda，Hori 等研究发现 TS 基定位于为类第 18 号染
14、色体上 1。TS 的功能是催化尿嘧啶脱氧核苷（dUMP）甲基化为胸腺嘧啶脱氧核苷（dTMP），这是 dTMP 从头合成途经中关键的步骤，而 dTMP 又是 DNA 的生物合成所必需的，因此，通过对 TS 进行抑制就能达到抑制 DNA 的生物合成, 进而抑制细胞生长或增殖的作用。5Fu 正是通过对 TS进行抑制而发挥其抗癌活性的。5Fu 进入体内后经过一系列酶促反应，最后转变为其活性代谢产物 5氟尿嘧啶脱氧核苷（5FudUMP ），它在辅因子 5,10亚甲基四氢叶酸存在下，能与 TS 结合形成等价的三联复合物 TSFdUMPCH2FH4，影响 dUMP 与 TS 的结合，从而抑制了 dTMP 的
15、合成，使 DNA 的合成受限，导致细胞生长受到抑制甚至死亡1。许多学者研究表明，癌组织中 TS 的表达水平与患者的预后呈负相关，TS 的表达可以作为判断癌症患者预后的指标2, 47，Tachikawa 和 Takenoue 等对肠癌患者的研究结果显示 TS 低表达组对 5Fu 的敏感性优于高表达组，其预后也明显优于 TS 高表达组8,9。Copur 等10对人类 H630 肠癌细胞株与其继发 5Fu 耐药株H630R1,H630R10,H630R 等进行比较，结果显示随着细胞株耐药性的增加，细胞中的 TS 水平也明显增加，这也从另一方面说明了 TS 对细胞耐药性的影响。本研究课题从活细胞水平上
16、对胸苷酸合成酶对结肠癌 5Fu 化疗耐药的影响进行了更进一步的探讨，结果显示结肠癌 TS 高表达组的体外培养的癌细胞对 5Fu 化疗药物的敏感性明显低于 TS 低表达组的体外培养的癌细胞，这种差别具有统计学上的意义（P0.05 ），这说明 TS 高表达组的患者对 5Fu 化疗的敏感性可能明显低于 TS 低表达组，因此容易产生耐药，与文献报道是相符的，进一步论证了胸苷酸合成酶的表达程度对临床结肠癌患者在化疗药物上的选择有一定的指导意义。【参考文献】1 Hori T,Takahashi E,Ayuasawa D,et al.Regional assignment of human thymidyl
17、ate synthase(TS) gene to chromosome band 18p11.32 by nonisotopic in situ hybridizationJ.Hum Genet, 1990,85(3):576580.2 Lenz H.J,Leichman C G,Danenberg K D,et al.Tymidylate synthase mRNA level in adenocarcinoma of the stomach:a predictor for primary tumor response and overall survivalJ.J Clin Oncol,
18、1996, 14(1):176182.3 Mader RM, Resistance to 5fluorouracilJ.Gen Pharmacil, 1998,31(5):661665.4 Yeh KH,ShunC T ,Chen C L,et al.High expression of thymidylate synthase is associated with the drug resistance of gastric carcinoma to high dose 5fluorouracilbased systemic chemotherapyJ.Cancer,1998, 82(9):
19、16261631.5 Johnston P G,LenzH J,Leichman C G et al.Thymidylate synthase gene and protein expression correlate and are associated with response to 5fluorouracil in human colorectal and gastric tumorsJ.Cancer Res, 1995, 55(7):14071412.6 Daries M M,Johnston P G,KaurS.,et al.Colorectal liver metastasis
20、thymidylate synthase staining correlates with response to hepatic arterial floxuridineJ.Clin Cancer Res, 1999,5(2):325328.7 Leichman C.G.Thymidylate synthase as a predictor of responseJ.OncologyHuntingt,1998,12(4):4347.8 Tachikawa D,Arimas and Futami K.Immunohistochemical exPression of thymidylate s
21、ynthase as a Prongostic factor and as a chemothera Peutic index in Patiemts with colorectal carcinomaJ.Anticancer Res, 2000,20(5):41034107.9 Takenou T,Nagawa H,Matsuda K, et al. Relaton between thymidylate synthase expression and surriral in colon carcinama,and determination of appropriate applicati
22、on of 5fluouracil by immuneohistochemical methodJ.Ann Surg Oncol,2000,7(3):193198.10CopurS, Aibak,Drake JC,et al.Thymidylate synthase gene aumplification in hnman colon cancor cell lines resitant to 5fluorouracilJ.Biochem Pharmacol，1995,17;49(10):14191426.编辑：李奇明；校对： 刘红武氟脲嘧啶药物敏感性与基因多态性研究进展关键词 氟尿嘧啶；化学
23、治疗；单核苷酸多态性；疗效；毒性 中图分类号 R979.1文献标识码 A 文章编号 1671-7562（2007）02-0138-04 基因表达谱的显著差异是指导肿瘤个体化治疗的基础，已有多种抗肿瘤药物通过检测相关分子及其基因多态性来预测患者对相应药物的敏感性和毒性。氟脲嘧啶(5-FU)是最常用的化疗药物，与其它药物组成了多种有效的化疗方案。胸苷酸合成酶（TS)、二氢吡啶酶（DPD） 、乳清酸磷酸核糖基转移酶（OPRT）等分别作为 5-FU 合成代谢和分解代谢的关键酶，在 5-FU 的作用途径中起着重要的作用，其基因的多态性与 5-FU 的疗效和毒性密切相关。 1 TS TS 是由两个相同亚基
24、组成的二聚体,作用于细胞周期 G1至 S 期,是嘧啶核苷酸合成的限速酶,也是 5-FU 发挥细胞毒作用的目标酶。肿瘤细胞对 5-FU 敏感性与 TS 基因（TS mRNA）相关，Fukushima 等 1用5-FU 处理人结肠癌 KM12C 细胞后得到对 5-FU 不敏感细胞（5-FU 的抑制率为 7.9%） ，其 TS 活性比未处理细胞（5-FU 的抑制率为 81.8%）高 23 倍，TS mRNA 水平的增加与 TS 活性的增加是一致的。Amatori等 2用 5-FU 处理 Colo 320、HT-29、CaCo-2 和 SW620 这 4 种肿瘤细胞，并通过检测肿瘤细胞对 5-FU 的
25、敏感程度，观察其与 TS mRNA 的关系。结果显示，在对 5-FU 最为敏感的 CaCo-2 中 TS mRNA 表达水平较低，而在对 5-FU 敏感性较低的 SW620 中 TS mRNA 高表达。 Lenz 等 3早年通过荧光定量 PCR 检测 65 例接受 5-FU 和铂类药物化疗胃癌患者的胃镜活检肿瘤组织TS mRNA 水平，发现 TS mRNA 水平高者中位生存期为 6 个月，而 TS mRNA 水平低者为 43 个月。Edler等 4用免疫组化法检测 862 例大肠癌患者（单独手术治疗/手术加 5-FU 辅助化疗）肿瘤组织中的 TS 蛋白水平，发现在单独手术组中低 TS 水平者生
26、存期更长(P=0.04)。Ciaparrone 等 5通过免疫组化方法检测 62例接受过含 5-FU 术后辅助化疗的结直肠癌患者肿瘤组织中的 TS 蛋白水平，结果发现，TS 蛋白水平是转移性结直肠癌患者无病生存时间（DFS）及总生存时间（OS）的独立预后因素。TS 蛋白表达水平低者，其 DFS 及 OS 优于 TS 蛋白表达高者。一项包含 13 项研究共 887 例进展期结直肠癌的 Meta 分析显示，高TS 蛋白表达者预后不佳 6。 在 TS 基因启动子区（TSER) ，即 5端末翻译区(5-UTR)存在 28bp 的重复片段多态性,与 TS 基因表达水平、5-FU 化疗敏感性及毒性反应、远
27、期生存率存在相关性。TSER 的 2 和 3 倍重复片断最常见，Marcuello 等 7通过对 89 例转移性结直肠癌患者的研究，把 TS 基因型分为高表达组（2R/3G、3C/3G、3G/3G）和低表达组（2R/2R、2R/3C 、3C/3C） ，结果发现，接受基于 5-FU 化疗后 TS基因型低表达组的中位生存时间为 50 个月，高表达组仅为 20 个月（P0.05） ，提示 TS 基因型可以作为转移性结直肠癌患者生存的独立预后因素。Matsui 等 8对 161 例接受过 5-FU 辅助化疗的结肠癌患者进行了前瞻性分析，寻找 TS 基因多态性与化疗疗效之间的关系。结果发现 11 例患者
28、（6.8%）TS 基因型为2R/2R 型，40 例（24.8%）为 2R/3R 型，110 例（68.3%）为 3R/3R 型。2R/2R 型的所有患者在研究结束时仍存活，但与其他两种基因型相比却无统计学意义。据此推测，TS 基因型为 2R/2R 的患者可以从基于 5-FU 辅助化疗中受益。 2 DPD DPD 是 5-FU 代谢的限速酶,体内 5-FU 剂量的 85%都是通过 DPD 代谢失活，DPD 活性丧失将导致严重的 5-FU 相关毒性反应。 Kuilenburg 等 9研究发现接受含 5-FU 化疗的患者中 DPD 活性高低是影响 5-FU 毒性的重要因素之一。DPD 基因（ DPY
29、D）到现在为止至少有 20 种突变与 DPD 活性降低和 5-FU 毒性反应有关。此后Kuilenburg10的深入研究表明,剪切位点突变 IVS14+1GA,即 14 内含子 5剪切位点处 GT 突变为 AT,导致DPD 失活。这是最常见的导致 5-FU 严重毒性反应的基因突变。在该项研究中 DPD 活性下降的患者中 28%为IVS14+1GA 突变 ,而正常者只有 4%的突变率,证明 IVS14+1GA 突变携带者具有发生 DPD 严重毒性反应的高风险。此外，DPYD 等位基因突变的杂合子发生严重毒副反应的几率比纯和子高,但纯合子发生的毒副反应往往是致死性的 11。肿瘤细胞内 DPD 水平
30、也是影响 5-FU 化疗疗效的重要因素,肿瘤细胞 DPD 活性和 DPDmRNA 表达水平与肿瘤的敏感性之间存在高度的相关性。Sato 等 12选取了 8 株肿瘤细胞，其中胆管癌细胞株通过基因修饰使DPD mRNA 低表达，结果显示 DPD mRNA 与 DPD 活性存在明显相关性，且发现 DPD 活性低的胆管癌细胞对 5-FU 敏感性较高。Hasegawa 等 13也在对接受含 5-FU 化疗方案的晚期结直肠癌患者长期生存时间与DPD 活性的研究中发现，DPD 活性低的患者能够从含 5-FU 化疗中得到生存受益。 与 5-FU 共同组成联合化疗方案的化疗药物是否会影响 DPD 而导致 5-F
31、U 毒性反应的改变，值得深入探讨。有学者应用 5-FU 与铂类、喜树碱类、紫杉类、丝裂霉素等联合干预结肠癌细胞，比较细胞中 DPD mRNA 表达情况，结果发现，所有化疗药物在与 5-FU 合用后均使得细胞中 DPD mRNA 的表达减少，具体机制尚不明 14。 3 OPRT 体内和体外实验研究显示 OPRT 是 5-FU 磷酸化的关键酶。在组织细胞内， 5-FU 被磷酸化后才能变成有活性的代谢物，进而通过抑制细胞 DNA 的合成和诱导 RNA 的功能障碍发挥作用。Mizutani 等 15在膀胱癌患者中发现 OPRT 高表达的患者比低表达者对 5-FU 有更高的敏感性，更易从 5-FU 的治
32、疗中获益，这一结果提示 OPRT 表达水平是预测 5-FU 敏感性的一个因子。在接受含 5-FU 术后辅助化疗的胃癌患者中同样发现 OPRT 表达水平与 5-FU 敏感性密切相关 16。OPRT 存在多种基因多态性，如638GC、1050TA、1336AG 等，但是研究发现 OPRT 多态性并未对 5-FU 敏感性产生影响 17。 4 嘧啶磷酸化酶（TP) TP 是 5-FU 前体药物卡培他宾(capecitabine)在体内转化为具有抗癌活性物质的关键酶 ,且与肿瘤细胞高复制、侵袭转移和肿瘤血管生成有关,并拮抗肿瘤药物的凋亡作用。 Xiao 等 18对 70 例结肠癌患者研究表明，TP 阳性
33、者比阴性者的 5 年生存率明显降低（33.33% vs 73.33%，P 0.000 1） 。但是,Yasuno 等 19对 97 例进展期结肠癌患者研究表明，肿瘤细胞 TP 阳性率为38%，间质细胞为 49%，肿瘤细胞 TP 表达率与血管密度有关(P=0.051)，而间质细胞 TP 高表达者预后较好(P=0.012 7)。Meropol 等 20利用免疫组化技术对转移性结直肠癌中肿瘤原发灶和转移灶中 TP 的表达水平与化疗敏感性及生存期之间的关系进行了研究，结果显示原发灶中 TP 的表达水平与化疗敏感性及生存期均有明显相关性，高 TP 表达提示更好的预后。 以上资料提示 TP 可能是结肠癌的
34、重要预后因子 ,依据 TP 的表达水平可以预测转移性大肠癌化疗敏感性。 5 亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) MTHFR 不可逆地催化 5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)，使其转变为 5-甲基四氢叶酸，从而削弱了 5-FU 的抗肿瘤作用。MTHFR 基因的多态性预测癌细胞对 5-FU 的敏感性可能具有较高的临床价值。 MTHFR 基因多态性最常见的是第 667 位的密码子发生了由 CT 以及第 1298 位密码子发生了由AC 的变异。Jakobsen 等 21在对 139 例接受含 5-FU 化疗的晚期结直肠癌患者的研究中发现，MTHFR基因第 667 位密码子为 TT 基因型者
35、对化疗有较高敏感性。而 Etienne 等 22采用 5-FU 干预 19 种人类肿瘤细胞，发现第 1298 位密码子突变型的 C/C、A/C 对 5-FU 药物的敏感性较高，而野生型 A/A 对 5-FU 药物敏感性明显低于突变型,可见 MTHFR 基因第 1298 位的密码子的多态性与 5-FU 的敏感性相关。 MTHFR 基因的多态性对于预后的影响至今仍有争议。一项包含有 1067 例接受含 5-FU 化疗的乳腺癌患者的研究结果显示，MTHFR 基因第 667 位 CT 的变异与进展期乳腺癌的长期生存时间相关，但与早期乳腺癌预后无明显相关性，其具体机制不明 23。但是在 2006 年有两
36、项研究 24-25发现，对于接受含 5-FU治疗的结肠癌和食管癌患者，其 MTHFR 基因的多态性与预后无关。6 尿嘧啶脱氧核糖三磷酸（dUTP）核苷酸水解酶（dUTPase） TS 活性抑制可致大量 dUTP 的积聚，dUTP 直接掺入 DNA，抑制 DNA 链的延长，还可以改变 DNA的稳定性，继而引起 DNA 链断裂，最终导致细胞的死亡。dUTPase 的过表达将限制 dUTP 的聚集，引起TS 相关的细胞毒性药物的耐受；而 dUTPase 的低表达使得 dUTP 聚集，从而提高药物的敏感性。关于dUTPase 与 5-FU 的敏感性关系的报道较少，Ladner 等 26发现肿瘤组织细胞
37、核中 dUTPase 过度表达的患者对以 5-FU 为基础的化疗不敏感，疾病进展时间和生存期也较短。但是目前仍缺乏大样本的研究来证实此结论。 7 展 望 现阶段临床上进行化学药物治疗常见的难题是肿瘤耐药和化疗药物的毒性反应，未来化疗的最终目的是实现根据肿瘤的反应以及宿主毒性反应的个体化治疗模式。随着检测技术的进步和检测结果评价的标准化，可以通过对接受含 5-FU 化疗的患者相关药物代谢酶分子表型和肿瘤基因型进行分析，在给药前对患者进行药理学筛选，从而制定个体化治疗方案，达到最佳治疗效果。 参考文献 1Fukushima M，Fujioka A，Uchida J，et al.Thymidylat
38、e synthase（TS）and ribonucleotide reductase（RNR）may be involved in acquired resistance to 5-fluorouracil（5-FU）in human cancer xenografts in vivoJ.Eur J Cancer,2001，37(13):1681-1687. 2Amatori F，di Paolo A，del Tacca M，et al.Thymidylate synthase，dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidine phosphorylas
39、e expression in colorectal cancer and normal mucosa in patientsJ.Pharmacogenet Genomics,2006,16(11):809-816. 3Lenz H J，Leichman C G，Danenberg K D，et al.Thymidylate synthase mRNA level in adenocarcinoma of the stomach:a predictor for primary tumor response and overall survivalJ.J Clin Oncol，1996,14(1
40、):176-182. 4Edler D， Hallstrom M，Ragnhammar P，et al.Thymidylate synthase expression in rectal cancer and proliferation，assessed by cyclin A and Ki-67 expressionJ.Anticancer Res,2002,22(5):3113-3116. 5Ciaparrone M，Quirino M，Schinzari G，et al.Predictive role of thymidylate synthase， dihydropyrimidine
41、dehydrogenase and thymidine phosphorylase expression in colorectal cancer patients receiving adjuvant 5-fluorouracilJ.Oncology,2006,70(5):366-377. 6Popat S，Matakidou A，Houlston R S.Thymydilate synthase expression and prognosis in colorectal cancer:a systematic review and meta-analysisJ.J Clin Oncol,2004,22:529-536. 7Marcuello E，Altes A，del Rio E，et al.Single nucleotide polymorphism in the 5 tandem repeat sequences of thymidylate synthase gene predicts for response to fluorouracil-based chemotherapy in advanced colorectal cancer patientsJ.Int J Cancer，2004,112(5):733-737.
