1、1时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一、产前筛查定义及其原理产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Downs Sydrome，DS；又称 21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs） ，也包括一部分 18三体综合征。产前筛查可以在妊娠早期（713 周）或中期（1421 周）进行。目前用于产前筛查的血清学标志物
2、有：甲胎蛋白（AFP） 、游离 -绒毛膜促性腺激素（F-hCG） 、游离雌三醇（uE 3） 、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A） 、抑制素 A（inhibin A）等。产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM） ，正常妊娠特定的 MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-hCG、PAPP-A 等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查 100%正确。
3、假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。二、唐氏综合征的产前筛查唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约 1/8001/600，男性多于女性。1866 年英国医生 Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为 Down， s Syndrome，简称 DS。1959 年 Lejeune首先发现本病的病因是多了一条 21号染色体，故又将其命名为 21三体综合征。唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约 50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。目前对 DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段
4、。1.以孕妇年龄作为筛查指标最早用于 DS的筛查指标为孕妇年龄。早期研究发现，DS 的发病率随孕妇年龄增高而增高，1977 年 Hook和 Chambers报道了孕妇年龄在 2030 岁之间，发病率呈线性增加，而在 33岁左右呈对数增加，孕妇年龄为 35岁时，发病率2约 1/384，40 岁时约 1/110，比 30岁时增加了 8倍，如图 1。一般认为 35岁以上的孕妇是 DS的高危人群，是要进行羊膜腔穿刺的指征。但深入研究统计发现，若仅以孕妇年龄35 岁作为筛查指标，DS 的检出率约 20%，而约 80%的胎儿 DS是在年龄小于 35岁的孕妇人群中。因此，不少国家的筛查机构指出“DS 产前筛
5、查应面向所有孕妇而不考虑年龄” 。仅用孕妇年龄指标不够全面，应结合应用孕妇血清标志物指标或超声波形态学联合筛查诊断。图 1 孕妇年龄与胎儿发生唐氏综合征风险的关系2. 以孕妇血清标志物为筛查指标1984年英国 Merkatz等最先发现怀有 DS胎儿的孕妇血清 AFP含量降低，这在产前筛查史上是一个划时代的进步，建议将 AFP作为 35岁以下孕妇胎儿DS的筛查指标。这一发现很快被其它实验室证实，1987 年 Bargot发现怀有 DS胎儿的孕妇血清中的 hCG的水平是正常孕妇的 2倍，以孕妇年龄再结合血清中hCG检测，DS 的筛查率可达到 63%。1988 年，Canick 等发现怀有 DS胎儿
6、的孕妇血清中 uE3的水平比正常孕妇低 25%。同年，伦敦 Bartholomews医院 Wald提出 AFP、-hCG、uE 3三联的筛查方法。1994 年美国妇产科学院向全美医学界正式推荐这一组合，并得到广泛应用，一直至今。在上世纪 90年代，有学者还相继发现 PAPP-A、inhibin A、糖原抗原 125（CA-125）等与孕妇怀 DS胎儿有关。也将逐步应用到 DS的产前筛查中。甲胎蛋白（AFP） 是胎儿血清中最常见的蛋白质，1956 年由 Bergstrandh和 Czar在人胎儿血清中发现的一种甲种球蛋白。早孕期由卵黄囊产生，晚孕期由胎儿肝脏大量产生。胎儿血中的 AFP经排尿进入
7、羊水并通过胎盘屏障渗入母血。孕 10周即可在母血中测出 AFP，孕 1120 周 AFP浓度呈线性升高，3234 周（有文献为 2832 周）达到高峰，以后逐渐下降，分娩后几天降为30。且孕早期以 AFP单项筛查胎儿染色体异常无意义，因此母血中 AFP的检测在孕中期 1420 周进行。正常孕妇血中 AFP含量变化见图 2与表 1。当孕妇胎儿患 DS时，由于胎儿生长发育迟缓，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，合成 AFP能力降低，致使孕中期母血清 AFP水平下降（一般2.5MOM） ，如图 3。表 2 正常妊娠母血清 hCG含量参考值（U/L）妊娠期（周） 受精后 距末次月经 U/L2 4
8、 51003 5 20030004 6 1000080000512 714 900005000001324 1526 5000800002638 2740 300015000摘自：周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验，第 3版.北京：人民卫生出版社，435.表 3 正常妊娠母血清 -hCG 含量参考值（mIU/ml）孕周 1 -hCG 孕周 2 -hCG 孕周 2 -hCG1 555 13 77335.73304.9 20 18568.73718.22 42100 14 5614624314.9 21 18046.16691.53 106500 15 48704.533045.5 22 2
9、0174.215022.34 631000 16 38275.421572.4 23 22282.35493.35 15010000 17 29620.611921.4 24 16393.14735.37 100015000 18 28100.511952.8 25 19403.97825.3912 120020000 19 29392.413482.8 26 174559505.5摘自：1.韦振元等.血清 -hCG、HPL 和 -hCG/HPL 比值对妇产科疾病的临床意义.标记免疫分析与临床，1999，6（1）：9-12.2. 王晓雯等.孕中期各周 -hCG 正常值测定及其临床意义.中国优生
10、与遗传杂志，2000，8（2）：62.5图 3 -hCG在正常孕妇和怀有唐氏胎儿孕妇血清中的分布游离雌三醇（uE 3） 是雌二醇（E 2）和雌酮（E 1）的代谢产物，在非妊娠女性中浓度很低，而在妊娠后期浓度则明显增加。只有约 9%的 E3在血液循环中游离为 uE3。在妊娠后期 E3由胎儿肾上腺、胎肝和胎盘大量合成，反映了胎儿和胎盘双方面的功能。母体血清 E3约 90%来自此合成途径，少量由母体卵巢前体生成。E 3生物合成途径的中断将导致母体血清 E3低水平。造成 E3途径中断的情况：胎儿宫内发育迟缓、无脑畸形、胎盘硫酸酯酶缺乏、死胎、染色体异常等，缺乏 E3的孕妇分娩期将推迟。在胎儿正常发育的
11、情况下，其母体内 uE3含量自 2934 周逐渐上升，3536 周开始快速上升，在 4142 周（3738 周或4041 周）达高峰，正常妊娠孕妇 uE3参考值见表 4与图 4。uE3被用于胎儿 DS筛查主要在孕中期，应注意正常妊娠孕妇 uE3是孕中期变化最大的指标，必须核对孕周。在孕妇怀 DS胎儿时，母体血清中 uE3表现为降低异常（一般2.5MOM 可见于唇裂、尿道下裂等。表 5 正常妊娠孕妇血清 PAPP-A参考值（mIU/ml）孕周 平均数 中位数 0.5倍中位数 2.5倍中位数4 0.008 0.012 0.006 0.0305 0.074 0.034 0.017 0.0858 0.
12、784 0.321 0.160 0.80511 4.946 3.269 1.634 8.17314 11.374 10.880 5.440 27.20017 16.253 15.783 7.892 39.45820 22.392 21.920 10.960 54.80023 26.076 25.820 12.910 64.55026 24.674 26.635 13.318 66.58829 30.361 27.210 13.605 68.02532 28.888 29.540 14.770 73.85035 35.108 31.310 15.655 78.27538 34.233 37.36
13、0 18.680 93.40041 31.765 34.460 17.230 86.150引自：章晓梅，李春华，冯怀英，等.孕妇血清 PAPP-A蛋白测定早期筛查染色体病.中国优生与遗传杂志，2001，9（2）：24-38.0.00020.00040.00060.00080.000100.0004 5 8 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41孕周系列 1系列 2系列 3系列 4注：4-41 周孕妇血清 PAPP-A浓度曲线，系列 1为浓度平均数，系列 2为中位数，系列 3为 0.5倍中位数，系列 4为 2.5倍中位数。图 5 正常妊娠孕妇血清 PAPP-A含量变化趋
14、势8抑制素 A（inhibin A） 被认为是一个由合胞体滋养层产生的化学物质，1992年有学者开始研究其与 DS胎儿的相关性，研究发现孕妇血清中与 DS胎儿相关的主要物质是二聚体抑制素 A。Aitken 等研究发现，在妊娠 78 周检测二聚体抑制素 A，怀 DS胎儿的孕妇血清中二聚体抑制素 A浓度较正常孕妇的高出2倍。进一步结合 AFP、hCG 能大大提高 DS的检出率，在一些多标记联合筛查中发现其作用不可忽视，甚至超过 uE3的趋势。糖原抗原 125（CA-125） 为一种大分子量糖蛋白，其生理功能目前尚有争议。1990 年 Cherk等报道孕早期孕妇血清中糖原抗原 125水平高于正常值，
15、可能与胎儿自发流产和 DS有关。1997 年 Wenstrom等用研究数据统计表明，这一标记在筛查 DS胎儿时，其阳性率可达 45%，并认为这一标记可用于多标记联合筛查。三、胎儿神经管缺陷的产前筛查胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs）是出生缺陷最常见疾病类型之一，其发病是由于受精后 2024 天内神经盘折叠过程中神经管不能闭合导致的。多数的神经管缺陷是开放性的，神经组织完全暴露或仅仅盖有一层薄薄的透明膜；只有极少部分损伤是闭合性的，神经组织由皮肤或一层很厚的膜完全覆盖。无脑畸形、脊柱裂、脑膨出是神经管缺陷三种主要类型。1977年首次报道血清中 AFP水平升高和开放
16、性神经管缺陷畸形有关，因为开放性损伤时胎儿体内高浓度的 AFP有可能通过胎儿血液循环到达羊水，再通过羊膜渗入母体循环，引起母体血清中的 AFP显著升高。因此通过检测孕妇血清中 AFP浓度可以进行神经管缺陷的产前筛查，可以检出 8090%的开放性神经管缺陷。在英国，由于开展了神经管缺陷胎儿血清筛查，其神经管缺陷胎儿的出生率从 1960年的 1/350降至 1987年的 1/2500,下降了 86。结果说明AFP是一个很有效的神经管缺陷筛查指标（一般2.5MOM，它在筛查胎儿神经管缺陷中的作用是其它标志物无法替代的） 。四、18-三体综合征的产前筛查18三体综合征可以用孕妇血清联合筛查，怀有 18
17、三体综合征胎儿的孕妇孕中期血清 hCG、AFP 和 uE3水平降低，以AFP0.75MOM；hCG0.55MOM；uE 30.60MOM 为切割值，18 三体综合征胎儿阳9性检出率可达出 6080%。五、产前筛查血清标志物的联合应用产前筛查各种不同血清标志物筛查特性见表 6。表 6 各种不同血清标志物筛查特性血清标志物 来源 适用孕周 阳性表现 阳性检出率 筛查胎儿缺陷 使用评价AFP 胎肝 152121三体，NTDs 30% 各种三体综合征，NTDs作用肯定，普遍应用-hCG 胎盘 821 21三体 51% 各种三体综合征作用肯定，普遍应用uE3胎儿肾上腺，肝脏，胎盘 1421 21三体 3
18、0% 各种三体综合征作用有争议，应用较普遍PAPP-A 胎盘合体滋养层 814 21三体 54% 各种三体综合征作用肯定，普遍应用INHA胎盘合体滋养层，黄体 1421 21三体 41% 各种三体综合征作用有争议，应用渐增多21三体综合征：妊娠中期母血 AFP下降，uE 3下降，F-hCG 上升（三联筛查方法） 。PAPP-A 和 F-hCG 在妊娠 10周左右有较大价值，PAPP-A 下降，F-hCG 上升，检出率达 63%，这个组合已成为孕早期筛查最佳组合。有学者认为四联筛查方法（AFP，uE 3，F-hCG，INH A）的检出率优于三联筛查方法。神经管缺陷：孕早期母血 AFP和 F-hC
19、G 正常，PAPP-A 下降；孕中、晚期 PAPP-A明显下降，AFP 上升。18三体综合征（Edward 综合征）：PAPP-A 和 F-hCG 具有孕早期筛查 18三体综合征的价值，母血 F-hCG 和 PAPP-A下降；孕中期，18 三体综合征母血 AFP下降，uE 3下降，F-hCG 下降。13三体综合征（Patau 综合征）：血清标志物变化与是否合并神经管缺陷有关。Turner综合征：妊娠中期 uE3下降，AFP 改变不明显或增高。如有胎儿非免疫性水肿 hCG上升，否则 hCG下降。染色体三倍体：当为 69条染色体时，血清标志物变化各不相同，一般认为AFP上升，uE 3下降，F-hC
20、G 或高或低。死胎：孕早期和孕中、晚期死胎，母血 F-hCG 和 PAPP-A均明显下降（胎盘功能破坏） ，而 AFP升高（胎肝合成的 AFP溢漏） 。多胎：AFP、uE 3、F-hCG 均升高。10六、产前血清标志物筛查的影响因素影响血清标志物的因素较多，易造成假阳性或假阴性，需采取措施予以纠正。1孕周估计误差：妊娠周龄对筛查结果计算十分重要，计算方法有两种：由末次月经（LMP）日期来推算，这种方法对月经周期规律者较好，但对月经周期不规则者不适用。超声波测量胎儿的双顶骨间径(BPD)是较正确的方法。当两种方法计算怀孕天数误差超过 10天时，则以 BPD为准；不足十天的两法均可。2. 多胎的影
21、响：双胎或多胎妊娠时，血清生化指标明显高于单胎妊娠。双胎的DS检出率要低于单胎。3. 孕妇体重：孕妇体重过重由于稀释作用可使 AFP、uE3、hCG 水平降低。4. 母亲自身疾病：孕妇患有一些其他疾病时，可影响生化指标。如孕妇为胰岛素依赖性糖尿病时，母血清 AFP比正常同孕周孕妇低 20%，而 uE3和 hCG水平升高。5. 母亲吸烟：孕妇吸烟使 AFP升高 3%，hCG 降低 3%，uE3 降低 23%。6. 种族差异：不同种族的人群正常值不同，AFP 在亚洲及黑人的水平较西班牙人和白种人高，hCG 在非裔美国人中较高。因此，不同种族人群应建立自己的正常值7. IVF与自然妊娠相比，hCG
22、明显升高而 AFP明显降低。七、产前筛查流程产前筛查流程：（遗传咨询） ，收集资料，采集血样，检测，风险评估，报告结果，病例追踪，遗传咨询，存档。如图 6、图 7与图 8。11图 6 产前筛查流程图图 7唐氏综合征（DS）产前筛查流程图图 8 神经管缺陷（NTD）产前筛查流程图八、产前筛查时间分辨荧光免疫分析法实验操作常规121. 时间分辨荧光免疫分析法试剂盒检测原理：目前已应用的有标记抗原与未标记抗原（待测或标准品）竞争结合抗体的竞争法、固相抗原与游离抗原（待测或标准品）竞争结合标记抗体的竞争法和固相双位点夹心法等。应用较多的为固相双位点夹心法，如夹心一步法和夹心两步法。方法简便，可以得到满
23、意的灵敏度和特异性，批间批内变异系数小，精密度高。TR-FIA 夹心两步法的检测示意图如图 9。图 9 TR-FIA 夹心两步法的检测示意图2. 时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程：如图 10。13实验室质量控制采用 TRFIA试剂二联法 AFP+HCG（F-HCG）报告唐氏综合征风险率及神经管缺陷的风险率。筛查项目及实验步骤简介（详见说明书）目的:保证每个孕妇样本的测定结果的稳定性、可靠性手段:1. 室间质评系统误差准确度2. 室内质控随机误差精密度室内质控是实验室质量控制的基础,提高常规测定工作的批间、批内标本检测结果的一致性。实验室检测系统误差原因分析 1、样本采集及方法或试剂分配器（
24、加样枪）不正确的调整；2、实验区域不恰当温度/湿度水平；3、试剂或校准物批号改变；4、使用、保存或运输过程中试剂变质；5、使用、保存或运输过程中校准物变质；6、使用、保存或运输过程中质控物变质；7、控制物非正确处理（冰冻） ；8、在无霜冰箱中控制无不恰当的保存；9、在实验系统中使用非试剂级别的水；10、仪器滤光片轮脏或光源减弱；11、仪器设备近来校准；12、实验操作人员变换。“室内”质控失控情况处理及原因分析 1、填写失控报告单上报实验室负责人。2、由负责人作出是否发报告的决定。3、分析失控原因重做同一质控物（人为差错、偶然误差）新开一瓶质控物（质控物使用、保管）重新校准（校准错误）进行仪器维
25、护，更换试剂（仪器、试剂）请专家帮助4、完成失控报告单主要实验步骤试剂盒复温标记物的稀释加样加入标记物工作液振荡孵育洗涤反应板加入增强液仪器检测图 10 时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程143. 仪器操作流程与注意事项仪器操作流程：开机软件注册软件登录软件使用（进入测试模块选择实验项目新建测试板孔测试拟合分析）退出软件关机填写仪器操作记录 ，具体操作如下：1. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪(后下方绿色按键)仪器后面电源开关，再按下泰莱-I 前面的白色按键启动计算机。2. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪右边的测试电源开关(绿色按键) 3. 打开电脑桌面 TALENT-I图标，进入软件登
26、录界面.4. 在登录界面中输入登录编号“1” ，再输入登录密码“1”. 5. 在进入半自动时间分辨荧光免疫分析仪软件主界面后，按如下指示操作：屏幕显示 具体操作界面右边显示“测试，报告，质控，历史，设置”点击“测试” ，进入下一界面界面左上方显示编号，项目类型，项目名称如：1.类型：甲状腺类 2.名称：T3 选择项目类型和项目名称后，进入右边新建测试界面，并选择最后一块板的结束孔位，点“确定” ，系统自动产生实验批号和实验板号，点“板孔测试”界面右边显示您所要测试的蓝色背景试管摆放图点界面右下角的“测试” ，仪器开始测试，测试完后点“板孔设定”显示“设定为标准品” ， “设定为质控” ， “设
27、定为样品”.填入试管摆放起始位.如第几排第几管.若做曲线，需点击“设定为标准品” ，并选好“复管数” ；若做质控，则点击“设定为质控”并选好高，中，低三种类型.在“设定为样品”一栏中，选好样品的起始位置，输入样品数，用 1到 N表示.每完成一项请点击“确定”.完成上述步骤后,点击“拟合分析”,界面右边显示有“拟合,曲线,结果,打印,保存”,中下边有“使用自测标准点进行拟合或校准”在“使用自测标准点进行拟合或校准”前打“”,即可得到测试分析后的曲线,点击“拟合”,得到测试浓度,要看曲线分析情况,点击“曲线”,拟合得到结果后点击“打印”即可以打印测试结果.6. 上述操作全部完成后,点击有整个界面右
28、下角的“退出”,即可退出 TALENT-I软件.7. 关闭 TALENT-I检测仪电脑主机部分及显示器的电源开关,然后关闭测试电源开关,最后关闭 TALENT-I仪器的总电源开关.8. 填写相关记录。注意事项：按照上面规定的开机和关机顺序进行开关机，以免损坏设备；15进行具体的测量前，保证检测仪部分开机预热 30分钟以上；出现故障时可以参考“故障排除”一节的内容进行排除；出现不能解决的问题时，请及时与我公司售后服务部联系。4. 实验操作与注意事项：以 AFP和 F-hCG 为例，见下表 7。1）.资料收集常规资料收集是最关键基础的一步，直接影响检测结果的分析。完整的资料包括：孕妇姓名、出生日期
29、、联系地址电话、孕周、体重、末次月经日期、月经是否规则、是否吸烟、胰岛素依赖型糖尿病、曾出生先天愚型、双胞胎。还有采样日期，因为绝大部分是采用末次月经来推断孕周的。影响因素与建议：对于月经不规则的孕妇，为了得到准确的孕周信息，要求其做 B超确定孕周。必须要有孕妇的签名，规避潜在的危险。个体差异可能导致漏检。2）. 血样采集常规采集时间：孕早期：7-13 周；孕中期：14-21 周。采集的量：3-5 毫升静脉血即可。标本保存：分离血清，4可保存 5天左右；条件允许-20冷冻保存。影响因素与建议：（1）标本中的 hCG随时间延长和温度增高会分解为 亚基和 亚基。由于游离的 亚基在血清中含量非常低，
30、分解出来的 亚基会在很大程度上影响 亚基的检测水平，而对完整的 hCG的影响则相对较小。因此用 亚基作为指标有可能增加假阳性率。为此实验室在运输或保存标本时要近量避免温度的升高。有学者研究表明，30 6h或 35 2h即可使项目浓度明显提高，血标本应及时分离（采用 3000rpm 6min以上或 2000rpm 15min） ，分析时室温较高且标本较多，建议将标本置于泠水浴中。 （2）本试剂采用的是一步法，不能采用血浆标本，EDTA、柠檬酸盐等螯合剂会影响铕标记的稳定性，使荧光值偏低。（3）标本避免反复冻融，会使检测物质活性（效价）降低。对溶血、黄疸、脂血等标本应在报告单上注明，特别含大量脂质
31、、严重黄疸及溶血或加热灭活之标本均可能影响检测结果，可建议重新采血。已稀释的血清不宜存放，稀释样本应先加稀释液，再加样本，避免非特异性吸附。3）. 试剂准备（1）微孔反应板：将试剂及所需数量的微孔反应板条平衡至室温16（2025） 。余下的微孔板条及时置入自封袋密闭并于 28保存。（2）洗涤液：将 40ml浓缩洗液和 960ml蒸馏水在干净的容器中混合，作为工作洗涤液备用。蒸馏水敬请用户自备。（3）标记物工作液：使用前配制，将 hAFP或 F-hCG 标记物与实验缓冲液按体积比 1：100 加进洁净的一次性容器中并混匀，当次试验用完。影响因素与建议：（1）免疫反应受温度影响，在一定范围内随温度
32、的提高，反应加快。平衡温度可保证实验反应的均一性。 （2）配置试剂采用去离子水或蒸馏水，避免酸、乙醇、螯合剂、氧化消毒剂等物质混入。 （3）准确配制洗液，洗液中 Tween20浓度高于 0.2%，可使包被于固相上的抗原、抗体解吸附而影响实验测定下限。 （4）标记物工作液要在使用前配制，容器洁净，充分混匀，避免水分挥发和污染（避免标记物的挥发造成实验室污染,导致本底过高） 。4）. 加样准确吸取 25l的 hAFP或 F-hCG 标准品标准品（Std） 、待测样本(Unk)，依次加入微孔反应板微孔中。影响因素与建议：（1）建议每次实验必须做标准曲线，待测样本作复孔检测。标准品复溶后 28可以保存
33、 6天；如长期保存请在20存放，并避免反复冻融。 （2）试剂要混匀，不可剧烈颠倒。加样枪要定时校准，在万分之一天平上误差10%。加样枪按钮压至第一档垂直握持，使吸嘴浸入液体，浸入深度:20ul 和 10ul1mm,100ul2-3mm，200ul 和 1000 ul2-4mm，5000ul3-6mm，10000ul5-7mm，避免枪头外残留过多，导致结果偏高。加样要准确一致，不可产生气泡、溅出，移液枪头要一次性使用，避免交叉污染，干吸头预先在血清中反复抽吸三次，保证吸样量准确，吸嘴要伸入反应孔底部 1/4-1/3处加样，停靠 5s，避免样本在反应孔上部滞留，导致非特异性吸附。使用连续加样枪，按
34、常规速度和程序，重复吸加 10次，计算误差率50ulCV1.5%，100ulCV1.0%，1000ulCV0.8%。定期进行定标，超标时予以更换。5）.加铕标记物向每孔中加入 200l已配好的标记物工作液，并加贴封片。影响因素与建议：一定要贴加封片，防止液体挥发和污染（避免标记物的挥发造成实验室污染,导致本底过高） 。对于同一批实验，使用同样的标记物，否则影响批内重复性和准确性。接触过标记物的吸头、测量完的板等含标记物17的物品要及时清理抛弃。6）. 孵育微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育（AFP（1 小时） ，HCG（一个半小时） ） 。影响因素与建议：（1）振荡器缓慢振荡孵育，缓慢
35、振荡可加快反应，使反应反应完全，但振荡过快容易产生气泡或使液体溅出，影响测定结果。 （2）严格讲，试剂与标本间，它们产生的基质效应是不可避免的。所以不可随便更改反应时间，如果反应时间不够，有可能导致样本反应不充分，影响检测下限。不可随便更改反应温度，室内实验温度要保证在1内，否则会影响结果天间的重复性。7）. 洗板孵育结束后，小心将封片揭下并弃掉，用洗板机洗涤 6次，拍干。影响因素与建议：（1）不可重复使用封片，避免交叉污染。 （2）洗板机洗涤后拍干，保证微孔残留液应2l，避免干扰结果。洗板机要定时消毒、清洁，洗板时要注意观察是否加满洗液，是否洗尽。洗板结束后，不要马上关闭洗板机，使用 RIN
36、SE命令冲洗管道。保持管道通畅，及时倾倒废液，保证有足够的洗液和蒸馏水，以免出现真空错误。对于同一批实验，请保证置于相同的实验条件下，如同样的洗液。8）.加增强液向每孔中加入增强液 200l。影响因素与建议：取增强液时，请采用中间过渡容器，请使用新吸头。加入过程中应悬空，避免吸头触及小孔内壁或其中的试剂，否则交叉污染，导致严重错误结果。9）.解离-增强微孔反应板条于室温下缓慢振荡 5分钟后上机检测，在 30分钟内完成检测。影响因素与建议：一定要贴加封片，防止液体挥发和污染（尘土中可能含有的稀土元素会影响试验结果，否则结果可能升高） 。分析仪器不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 15-3
37、0，使用前先预热仪器 15-30分钟，测读结果更稳定。还必须注意仪器的开关机。10）.结果分析18影响因素与建议：（1）严格使用 TRFIA F-hCG 测定程序，及时修改参数和数据处理模式，保证结果的准确可靠。 （2）评价实验结果的要素：a） 标准品线性佳，变异系数小；b） 质控品在受控范围内，批内 CV5%，批间 CV10% ( 期望值 )。美国 CLIA88能力比对检验分析质量要求：AFP 和 HCG均为靶值3SD内；c） 样品值符合正态分布。 （3）本试剂采用的是一步法，若待测样本中抗原浓度过高，会出现高浓度后带现象，即“钩状效应” （ hook effect ） ，此时免疫反应被明显
38、抑制，出现错误的低值，要消除这种干扰，只有对样本进行适当稀释后重新测定。11）.其他（1）彻底理解本说明书并严格按规定操作对成功使用本试剂盒很重要。（2）尽量建立洁净的实验室环境，这对成功使用本试剂盒起到重要作用。（3）试剂盒中所提供的试剂组份为一配套整体，请不要混用不同批号和使用过期的试剂。对所使用的试剂进行名称、批号、收到日期、使用日期和有效期的登记。（4）本试剂盒和所有待测样本均可能成为潜在传染源，请按相关生物安全防范措施处理。（6）本试剂盒启封后需在两周内用完。（7）实验设备建立检测标定档案。仪器使用前，检测并记录灵敏度，误差率等参数，未达到标准，校准后使用。定期维护保养。实验室仪器应专人保管，定期维护保养，建立使用档案及操作者签名制度。（8）实验技术人员必须要有较强的责任心和事业心，不断提高自身的业务水平，自觉地保质保量地完成筛查工作任务。
