1、生物工艺学（生物技术）的概念与特点是应用自然科学及工程学原理依靠生物催化剂的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。（现代）发酵工程的概念与基本步骤主要指利用微生物、包括利用 DNA 重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。包括以下基本步骤：（1）菌种选育；（通过细胞诱变或基因工程技术改造等）（2）细胞大规模培养即发酵过程；（3）生产活性的诱导；（在发酵特定阶段，用化学或物理法）（4）菌体及产物的收获（利用浓缩、吸附、过滤、离心、萃取、干燥、重结晶等手段）发酵工程概念、内容和过程要求 概 念：指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产
2、品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。 内 容：菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等。 要求：a.要随时取样检测培养液中的细菌数目、产物浓度等，以了解发酵进程；b.及时添加必需的培养基组分，以满足菌种的营养需要；c.要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。微生物发酵工业特征 反应条件温和通常由于微生物的生理特性，要求温度为 30-40pH 值中性偏酸性酵母、霉菌、放线菌等pH 值中性偏碱性细菌的发酵 无菌发酵整个反应过程要求无菌：培养基无菌、空气无菌、 补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。 非连续性生产微生
3、物的生理特性决定了发酵过程的非连续性大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是：啤酒的连续化生产获得发酵产品的条件 适宜的微生物 保证或控制微生物进行代谢的各种条件 进行微生物发酵的设备 精制成产品的方法和设备发酵工程的发展历史；青霉素发酵的主要的技术进展与意义 发展历史发酵-古老的艺术初期-微生物发现近代-深层发酵技术现代-DNA 重组及细胞融合技术 技术进展通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。 抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养 基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。 意义：抗生素工业的发展 建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培
4、养方法 推动了整个发酵工业的深入发展 为现代发酵工程奠定了基础代谢控制发酵理论的要点 定义：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物 要点：大多数的工业产品并不是微生物代谢的末端产物，而是微生物代谢的中间性物质，要合成、积累这些物质，必须解除他们的代谢调控机制。通过遗传学或其它生物化学的方法，人为地在脱氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，(无定向诱变)改变和控制微生物的代谢，使有用的代谢产物大量生成、积累的发酵技术。基因工程菌发酵的技术特点和意义 技术特点:可定向改造生物基因，按人们的意志生产产品。 意义:将引起发酵工程的技术革命。工业发酵的步骤(1) 用作培养菌种及扩
5、大生产的发酵罐的培养基的配制(2) 培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3) 将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4) 将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5) 将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品(6) 回收或处理发酵过程中产生的废物和废水微生物发酵的本质可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的营养物转化成特定的产物培养基的配制原则（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）（二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）（三）物理化学条件适宜（条件适宜）（四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）不同微生物对水分活度的要求细菌：一般
6、0.900.98；嗜盐菌 0.75酵母菌：一般 0.870.91；高渗酵母 0.610.65；鲁氏酵母 0.60霉菌：一般 0.800.87；耐旱菌 0.650.75；双孢旱霉 0.60如何理解“根据培养基的应用目的选择原料及其来源”该培养基的应用目的，即：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定代谢产
7、物的前体物；当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉 的原料，提倡以粗代精，以废代好。实消（批式灭菌）的工艺操作要点 定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。 灭菌之前，先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并且用空气吹干。 开始灭菌时，放出夹套和蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。升温时，打开所有排气阀门，排掉空气 当培养基温度升到 70左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽，培养基温度达 120，罐压达 1105Pa(表压)时，安装在发酵罐封头上的接种、补料、消沫
8、剂、酸、碱管道应排汽，并调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在这一水平进行保温 3045min。 在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道以及冲视镜管都应通入蒸汽，在液面上的其余各管道则应排放蒸汽，目的是对管道进行灭菌。这样才能保证灭菌彻底，不留死角。 保温结束后，依次关闭各排气、进汽阀门，待罐内压力略高于大气压力时，向罐内通入无菌空气，在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力；否则，培养基将倒流入过滤器内。在夹套和蛇管中通入冷水，使培养基温度降到所需温度。 引入无菌空气？保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌，甚至设备损坏。微生物所需要的五大营养要素包括
9、碳源、氮源、无机元素、生长因子及水发酵培养基的选择、设计和注意事项 (1)必须提供合成微生物细胞、代谢活动和发酵产物的基本营养成分。（如何理解？） 对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 生产氨基酸等含氮化合物时，除充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。 主成分与其他成分的配比。 合适的 pH：微生物的生长繁殖或产物合成需要特定的 pH 环境。 合适的浓度：从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中推算所需原料或主要原料的需要量。 柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量， 钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用， 钴
10、离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的。 (2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。 (3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。 (4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。大量地接入培养成熟的菌种的优点 1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率， 2. 节约了发酵培养的动力消耗， 3.并有利于减少染菌机会。淀粉质原料的处理过程预处理，水热处理，蒸煮，糖化处理代谢所需的底物只能是 Glucose 等单糖或双糖的微生物 酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等 大部分的细菌：GA 产生菌、Lys 产生菌、苏云
11、金芽孢杆菌等淀粉水解程度的检测方法 1，测定还原糖， 2，酒精法，碘液法。糖蜜原料的处理过程 包括稀释、酸化、灭菌、澄清和添加营养盐等过程基本概念：培养基(medium)、碳氮比（C/N）、生长因子、前体物质、糖化力单位、DE 值、Bx(糖度) 培养基：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质（混合养料） 。 C/N 比值=碳源中的碳原子的 mol 数/氮源中所含的氮原子的 mol 数 生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质 前体物质：指某些化合物加入到发酵培养基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但产量却
12、因前体的加入有较大提高。 糖化力单位：1g 曲在 2%的可溶性淀粉溶液中，60、1h 糖化可溶淀粉转化成葡萄糖的毫克数， DE 值：是表示淀粉或转化淀粉按葡萄糖计算时的总还原值，以对总干物质的百分率表示。 Bx（糖度）：是表示糖液中固形物浓度的单位，工业上指 100 克糖溶液中，所含固体物质的溶解克数。微生物工业对菌种的要求 能在廉价原料制备的培养基上迅速生长和生成所需的代谢产物产量高。 培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）种子罐的接种方法 微孔接种法、火焰保护法、差压法种子罐级数（制备种子需逐级扩大培养的
13、次数）的决定因素 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； 所采用发酵罐的容积 工艺条件根据“菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度”，不同微生物的种子罐级数如何？ 细菌：二级发酵。 霉菌：三级发酵 放线菌：四级发酵 酵母：一级种子微生物菌种的来源 根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种工业菌种育种的方法 自然选育、诱变选育、杂交育种、原生质体融合技术育种、基因工程育种诱变育种步骤？说明其中“中间培养”的重要性 出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选 由于表现延迟 (生理延迟)，需 3 代以上的繁殖才能将突变
14、性状表现出来。筛选营养缺陷型的步骤？检出营养缺陷型的原理与方法 诱变 淘汰野生型 检出缺陷型 确定生长谱 原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在 CM 上生长良好，而在 MM 上则不生长，野生型都能生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法 柠檬酸产生菌的育种 柠檬酸发酵和其他代谢控制发酵一样，都是在环境水平上的代谢控制发酵，亦即，选育有代谢技能的突变株， 在有控制的培养基上，在有选择的条件下 ，才能大量合成产物。 1.透明圈大的菌株平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO 3诱变后，涂布，透明圈大的则好，为何？淀粉的水解能力。 2.现色圈大小平板：麦
15、汁培养基 + pH 值指示剂诱变后，33培养 3 天，透明圈大的则好。为何？产酸量大。 3.不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源进行生长的菌株，说明其 TCA 循环中柠檬酸后述的酶的活性较低，或者丧失，这有利于柠檬酸的积累。 方法：以柠檬酸为唯一的碳源的培养基上，选择生长不好的突变株。 4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使 TCA 循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。（中间产物少，C 架少，不利于合成代谢）初级代谢产物与次级代谢产物的概念、主要特征与区别 （1）初级代谢产物 定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖
16、所必需的物质。 特征：不同的微生物初级代谢产物基本相同；初级代谢产物合成过程是连续不断的。 （2）次级代谢产物 定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。 特征：不同的微生物次级代谢产物不同；抗生素是一类具有特异性抑菌和杀菌作用的有机化合物。 （3）初级代谢产物与次级代谢产物的主要区别： 对于微生物生长的作用不同 产物结构不同 产物形成的时间不同微生物是如何实现细胞内的代谢调节的 微生物细胞内的代谢调节主要通过酶合成量、酶活性及细胞膜透性的控制实现。微生物代谢中酶合成量调节与酶活性调节的异同点为什么要选用高丝氨酸营养缺陷
17、型作为赖氨酸生产菌株？写出黄色短杆菌中Lys 代谢途径，说明利用黄色短杆菌发酵生产 Lys 的菌种特性和控制要点 （1）天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受 Lys、Thr 的 协同反馈抑制 ，协同反馈抑制，就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。 （2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，即优先合成Hos（高丝氨酸），然后再优先合成 Met，当 Met 过量时， 阻遏 ：催化Hos:琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成
18、酶），使代谢流向合成 Thr 的方向进行，当 Thr 过量时， 反馈抑制： Asp-半醛:Hos 所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向 Lys 的合成上。 （1）解除了 Hos 的优先合成机制，阻断了代谢向 Met、Thr 的方向进行，节省了原料，可以使 Asp-半醛这个中间代谢产物全部转入 Lys 的生物合成上。 （2）在培养基中限量的供给 Met 、Thr（或者 Hos），对于 AK 酶活性的调节有着重要意义。因为 AK 酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则 Lys 的浓度再高，也不会影响到 AK 酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行
19、，使得产物的合成畅通无阻。 E.coli 培养在 Gluose + 乳糖的 Medium 中出现二次生长即发酵逆转 的原因 E.coli 在利用 Glucose 时，分解利用乳糖的酶:-半乳糖苷酶的合成受阻，只有当 Glucose 被利用完以后，上述这种对 -半乳糖苷酶合成的阻遏作用随之消失，于是出现了菌体利用乳糖进行生长的第二个对数生长期。 给生产带来的危害：在正常的发酵过程中，微生物群体从完成了生长型到产物积累型的转变后，大量的产物开始生成，底物源源不断地转化成产物，但是当培养基中存在易引起分解代谢阻遏的物质时，菌体可能出现二次生长，微生物群体又回到了生长状态，即发生了发酵逆转，这显然是不
20、利于提高产量的。组成型酶变异株的筛选方法（1）恒化器法；（2）循环培养法；（3）诱导抑制物法；生产中克服分解代谢阻遏的措施（1）抗性突变株的选育：从遗传学看，如果调节基因发生突变，使阻遏蛋白失活；操作基因发生突变，不能与阻遏蛋白结合，那么这种分解代谢阻遏就不存在，有利于代谢产物的过量生产。（2）生产中避免使用有阻遏作用的 C 源、N 源目前已知的不易引起分解代谢阻遏的 C 源：乳糖、有机酸；目前已知的不易引起分解代谢阻遏的 N 源：黄豆粉，黄豆粉之所以不易引起分解代谢阻遏，是因为黄豆粉是一个颗粒状的原料，其中的蛋白质存在于颗粒中，起到缓释的作用。（3）流加 C 源、N 源缓慢的流加 C 源、N
21、 源，使发酵培养基中的 C 源、N 源一直保持在一个均匀的、较低的水平，则有利于消除分解代谢阻遏的出现，可以明显的提高产量。防止突变株的回复突变的方法（1）选择具有双重标记的突变株。例如，在 Lys 的发酵中选育具有 Hos- 和 Met- 的双重标记菌株，可以提高其稳定性。（2）对于抗性突变株。可以在培养基中加入适量的结构类似物，以防止已经发生回复突变株的抗性突变株 的增殖。改变细胞膜透通性的方法（1）改变膜的组成与结构，使之成为不完整的细胞膜。 （2）破坏细胞壁的合成，使之不能合成完整的细胞壁，由此，细胞膜由于缺乏细胞壁的机械保护作用可以改变其渗透性。（3）透通性酶活性的调节与控制：细胞膜
22、对于要输送的物质具有高度的选择性，这种高度选择性与透通性酶的活性、结构有着直接的关系，而透性酶与其他酶相同，也有着自己的调节与控制机制。研究这种机制，有利于提高微生物的代谢产物的过量生产。前体（前驱物质）在提高次级代谢产物中的作用，举例说明在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体，可以有效的提高次级代谢产物的产量。举例：在青霉素 G 的发酵法生产中，补加前体物质，苯乙酸 or 其衍生物，可以明显的增加青霉素的产量。因为，在青霉素的发酵生产过程中，苯乙酰-CoA 是青霉素 G 生物合成的限速性因子，受到许多代谢控制，添加苯乙酸 or 其衍生物后，可以提高苯乙酰-CoA 的浓度，解除了
23、苯乙酰-CoA 对于青霉素 G 合成的限速，从而提高青霉素的产量。放罐时间对下游工序的影响（1）放罐时间过早，会残留过多的养分，如糖、脂肪、可溶性蛋白等，对提取不利，这些物质能增加乳化作用或干扰树脂的交换；（2）放罐时间太晚，菌丝自溶，不仅会延长过滤时间还会使一些不稳定的抗生素单位下跌，扰乱提取工段的作业计划。判断放罐的指标有哪些？产物浓度、过滤速度、氨基氮、菌丝形态、pH 值、培养液的外观、粘度等。柠檬酸的发酵中侧系呼吸链的作用在柠檬酸的发酵微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（20 分钟）
24、 ，则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的 ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败， （大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统） 。基因工程菌的发酵过程目的基因获得载体连接引入宿主工程菌发酵表达提取工程菌的不稳定性（1）质粒不稳定：质粒的丢失；重组质粒发生 DNA 片段脱落；（2）产物表达不稳定（产物发酵水平波动较大） 。发酵温度对工程菌发酵的影响 基因工程菌生长的最适温度往往与发酵温度不一致，一般，控制温度以达到前期高
25、效繁殖，后期高效表达的目的。温度同时还影响目的产物（蛋白质）的表达形式和稳定性。外源蛋白质表达时，在较高温度下表达包涵体的菌种，常常在较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。对于温度诱导的大肠杆菌表达系统，在生长期维持为 37，在产物生产期要提高温度，一般为 42，启动外源基因转录、翻译等过程，实现产物的最大限度表达。对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温诱导，然后降低温度，进行变温表达，避免蛋白质不稳定性降解。 （1）对于大多数的基因工程菌，在一定温度范围内，随着温度升高，质粒稳定性下降。（2）对于大肠杆菌往往在 30左右质粒稳定性最好。（3）对于采用温敏启动子控制的质粒，大肠杆菌由 30升高到
26、42诱导外源基因表达目标产物时，经常伴随质粒的丢失。为此，可以建立基于温度变化的分步连续培养。在第一个反应器中，30下进行生长培养，增加质粒稳定性，然后流入第二个反应器中，在 42下进行诱导产物表达。可见温度的控制相当重要，必须选择适当的诱导时期和适宜的诱导温度。基本概念：种子扩大培养、诱变育种、营养缺陷型、基因重组育种、杂交育种、初级代谢产物、次级代谢产物、葡萄糖效应、临界菌体浓度（1）种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。（2）诱变育种：在人为地条件下，利用物理，化学等因素
27、，以诱发基因突变为目的的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。（3）营养缺陷型：指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。（4）基因重组育种：是运用体外 DNA 各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达；或通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。（5）杂交育种：一般是指两个基因型不同的菌株通过吻合（接合） ，使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌
28、株。（6）初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。（7）次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。（8）葡萄糖效应：又称为分解代谢产物阻遏，当细胞在易于被利用的碳源上生长时，有些参与分解代谢的诱导酶的合成往往受到阻遏，这就是葡萄糖效应。（9）临界菌体浓度：摄氧速率与氧传递速率平衡时的菌体浓度。氨基酸的制备方法有哪些？发酵法：发酵法又可分为直接发酵法与添加前体的发酵法。添加前体法是以氨基酸的中间产物为原料，用微生物法转化为相应的氨基酸。提取法：将蛋白质原料用酸水解，然后从水解液中提取氨
29、基酸。目前，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生产。酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。合成法：用化学合成法制造的氨基酸有 DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。谷氨酸产生菌的主要特征1. -酮戊二酸氧化能力微弱: -酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低.2. 谷氨酸脱氢酶活性强.3. 还原性辅酶(NADPH +H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱.4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱.5. 不利用谷氨酸.6. 耐高糖耐高谷氨酸 .7. CO2固定能力强.8.解除谷氨酸反馈抑制.9.具有向
30、胞外分泌谷氨酸的能力.谷氨酸生产菌细胞膜的通透性实验是如何进行的？ 用能积累谷氨酸菌株做如下实验:1. 生物素充足时,细胞内含大量谷氨酸,但培养液里几乎不含谷氨酸2. 用溶菌酶消化细胞壁得到的原生质体仍不分泌谷氨酸3. 当把原生质体放入低渗溶液里,将其涨破,谷氨酸才排出4. 生物素亚适量时,培养液里含大量谷氨酸,细胞里含量少 结论:谷氨酸的分泌是由细胞膜控制6 条 GA 的生物合成途径或反应葡萄糖的酵解，EMP葡糖糖的有氧氧化，HMP丙酮酸的有氧氧化，TCA 循环乙醛酸循环途径，DCA 循环CO2 固定反应-酮戊二酸的还原氨基化谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的 GA，其菌种内在的原
31、因有哪些？GA 产生菌必须具备以下条件：（1）生物素缺陷型 谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量) ,引起菌种代谢失调, 使谷氨酸得到大量积累。（2）具有 CO2 固定反应的酶系 菌种能利用 CO2 产生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量积累。（3）-酮戊二酸脱氢酶酶活性微弱或丧失体内 -KGA 脱氢酶活性很低时，TCA 循环才能够停止，-KGA 才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。（4）谷氨酸产生菌体内的 NADPH 氧化能力欠缺或丧失，NADPH 是 -酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸必须物质，而且该还原氨基化所需要的 NADPH 是与柠檬酸氧化脱羧
32、相偶联的。（5）产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶，DCA 循环的封闭是实现谷氨酸发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着 -酮戊二酸的方向进行, 从而有利于谷氨酸的积累。（6）菌体有强烈的 L-谷氨酸脱氢酶活性L-谷氨酸脱氢酶，实质上 GA 产生菌体内该酶的酶活性都很强，-酮戊二酸易生成谷氨酸。谷氨酸产生菌之所以能够在 10%以上的葡萄糖培养基上，生产大量的 GA,除了上述谷氨酸产生菌的内在本质外，其需要的外在条件有什么？（1） 供氧浓度（通风）过量：NADPH 的再氧化能力会加强，使 -KGA 的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的 pH
33、值下降，不利于 GA 的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的产出率。（2） NH4+浓度（1）影响到发酵液的 pH 值（2）与产物的形成有关：NH4+过量，菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段 Glu 会受谷氨酰胺合成酶作用转化为 GlnNH4+不足，不利于 -KGA 的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调节（3）磷酸盐：过量：（1）促进 EMP 途径，打破 EMP 与 TCA 之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等 （2）产生并积累 Val， （4）发酵液的碳氮比：在碳源和氮源的比为 31 时（发酵期） ，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的比为 4
34、1 时（长菌期） ，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。（5）生物素：亚适量（6）发酵温度：谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即 3032 。发酵中、后期菌体生长基本停止, 为积累大量谷氨酸，应适当提高发酵温度，但温度过高,酶易失活，谷氨酸生成受阻。（7）pH 值pH：前期 pH（7.58.0） ，中后期 pH7.07.6。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节 pH，补充氮源。 （8）泡沫：(1) 泡沫形成泡盖时, 代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢; (2) 泡沫过多, 发酵液会外溢,造成浪费和污染; (3) 泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。谷氨酸发酵过程
35、中，生物素（ VH）作用表现在那几个方面？(1)生物素对糖代谢的影响：VH 对于糖酵解有促进作用；对丙酮酸的有氧氧化乙酰辅酶 A 的生成也有促进作用；可以通过控制 VH 的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。DCA 循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶。封闭乙醛酸循环对于谷氨酸发酵的重要性。（2）生物素对氮代谢的影响当 VH 缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱。当 VH 丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则 DCA 循环正常进行，DCA 循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物” ，另一方面，菌体的能荷水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增
36、殖和生长，则谷氨酸的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。（3） VH 对菌体细胞膜通透性的影响谷氨酸发酵采用的菌种都是 VH-，而 VH又是菌体细胞膜合成的必须物质（如，将乙酰辅酶 A 羧化生成丙二酰辅酶 A 的酶是乙酰辅酶 A 羧化酶，该酶的辅酶是VH） ，因此，可以通过控制 VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。生物素（VH）如何封闭乙醛酸循环的？ DCA 循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：为醋酸诱导受琥珀酸阻遏，其活性受琥珀酸的抑制？（受到 Glucose 的阻遏） 当 VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧
37、氧化就会减弱(由于 VH对 TCA 循环的促进作用)，则：乙酰辅酶 A 的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；（2）V H对 TCA 循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强； 两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA 循环得到封闭。发酵过程中为什么要严格控制磷酸盐的含量磷酸盐：是微生物生长和发酵所必须的，不能缺少。但，如果过量：（1）促进 EMP 途径，打破 EMP 与 TCA 之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等 （2）产生并积累 Val，Val（1）可以抑制葡萄糖 生成 丙酮酸，使 GA 的生物合成受到阻止（2）消耗丙酮酸，降低了糖酸转化率（3）发酵液中的 Val 存在，严重的影响 GA 的结晶、提取。从能荷的角度解释谷氨酸发酵过程中，“只长菌，不产酸”的原因。 当 VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱。 当 VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则 DCA 循环正常进行，DCA 循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能荷水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则 GA 的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“ 只长菌，不产酸 ”的现象。谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系
