1、探讨如何运用模式生物研究 SCN5A 的功能第一章，背景知识利用模式生物来研究生物学问题是指利用生物进化的保守性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息运用于其他生物。往往利用一些技术上更容易操作的生物来研究高等生物的生物学问题。 斑马鱼作为模式生物的优点在分类学上，小鼠属于哺乳纲，由小家鼠演变而来。它广泛分布于世界各地，经长期人工饲养选择培育，已育成 1000 多近交系和独立的远交群。1成熟早，繁殖力强。小鼠 67 周龄时性成熟，雌性 3550 日龄，妊娠期为 1921 天；哺乳期为 2022 天；一次排卵 1023 个（视品种而定） ，每胎产仔数为 815 头，一年产仔胎数 61
2、0 胎，属全年、多发情性动物，繁殖率很高，生育期为一年。2对外来刺激极为敏感。对于多种毒素和病原体具有易感性，反应极为灵敏，如百万分之一的破伤风毒素能使小鼠死亡，这是其他实验动物所不能比拟的。对致癌物质也很敏感，自发性肿瘤多。3便于提供同胎和不同品系动物。可根据实验要求选择不同品系或同胎小鼠做实验，也可选择同一品种（或品系） 、同年龄、同体重、同性别的小鼠做实验，由于动物遗传均一，个体差异小，实验结果精确可靠。经长期人工饲养选择培育，已育成多达千余个独立的远交群和近交系。由于小鼠繁殖快，饲养管理费用低，所以成为生物医学研究中广泛使用的模式生物，也是当今世界上研究最详尽的哺乳类实验动物。小鼠胚胎
3、干细胞的分离和基因敲除技术的应用，更为以小鼠为对象的发育生物学研究起了推波助澜的作用。2002 年 8 月公布了老鼠基因组物理图谱的框架。随后完整的老鼠基因组图谱也完成。 SCN5A 基因简介SCN5A 基因是位于 3 号染色体 p21-23 处，编码心脏钠通道 亚单位Nav1.5 的亚单位的基因。在窦房结上有很多跨膜电流参与心脏起搏活动的形成。Nav1.5 通道在窦房结电生理活动中发挥着重要的作用，心肌细胞上主要的钠通道是 NaV1.5，功能增强或者功能减弱均可导致快速/ 缓慢型心律失常的发生。在窦房结上，阻断钠通道可以导致起搏活动的减弱以及延缓窦房结动作电位的传导。研究还发现，SCN5A
4、基因的突变可以导致 Nav1.5 通道蛋白表达运输的障碍，以致细胞膜上通道蛋白数量减少。细胞膜上钠通道数量，对保障细胞的快速去极化至关重要。数量的降低，会严重降低去极化的速率，导致 0 期去极化的幅度减低，传导速度降低。自从 1995 年以来，编码 Nav1.5 的 SCN5A 中有至少 170 个自然发生的突变可以引起心脏疾患，包括诸如先天性的和获得性的长 QT 间期综合征，Brugada 综合征，传导紊乱以及婴儿猝死综合征，病态窦房结综合征和心房颤动以及扩张型心肌病。这一系列的研究说明 Nav1.5 通道对心肌细胞动作电位的产生和传导以及其它生理功能发挥着重要的作用。因此通过对 SCN5A
5、 基因的缺失，就可能导致 Nav1.5 通道功能的改变，模拟出人类相应的疾病。Scn5a 基因敲除小鼠模型的建立及鉴定遗传病是由于遗传物质发生改变造成的，如基因突变或者染色体畸变等。基因打靶技术是能够修饰和改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传的技术。通过基因打靶途径建立的基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠） ，是研究疾病的发生机制，分子基础及诊断的主要动物模型。Papadatos等利用转基因技术开发出 Scn5a 基因部分敲除小鼠。纯合子小鼠心室腔严重的发育性缺陷，从而导致胚胎死亡；而杂合子（Scn5a+/-）小鼠 Nav1.5 通道电流减小，可以表现为室性心动过速等心律失常
6、。Scn5a+/-小鼠心肌细胞的 Nav1.5 通道电流较野生鼠明显减小，而通道的激活和失活没有改变，提示存在着 Nav1.5 通道表达运输的障碍，同时也观察到Scn5a+/-小鼠可以出现缓慢型的心律失常。因此， Scn5a+/-小鼠也为研究钠通道电流减弱所致的窦房结功能障碍提供了可能的动物模型。在该研究中通过对Scn5a+/-小鼠窦房结细胞 Nav1.5 通道电流和表达，以及窦房结等传导组织电生理特性的研究，阐明 Scn5a 基因缺失导致窦房结功能障碍的机制。基因敲除小鼠的基本程序获得目的基因的同源片段，将此 DNA 片段克隆到一般的质粒载体中，从重组质粒中切除目的基因的大部分同源 DNA
7、序列，只保留部分序列在线性载体中，将带有 GFP-neo 基因和 HSK-tk 基因克隆到此线性载体中构成打靶载体。通过显微注射法将打靶载体导入 ES 细胞，以载体上的 GFP-neo 基因置换 ES 细胞基因上的目的基因，从而得到丧失了目的基因的 ES 细胞。 基因敲除 ES 细胞注射入胚泡 将基因敲除的 ES 细胞注射入胚泡中，使其与源胚泡丛的细胞共同组成胚泡的内细胞团。 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 将含有基因敲除 ES 细胞的胚泡移植到假孕小鼠的子宫腔内，使 ES 细胞有机会发育成为小鼠或某种组织。这种胚泡中既含有基因敲除 ES 细胞，又含有胚泡原有的正常 ES 细胞，因此，这种胚泡发育所
8、产生的后代中有源于基因敲除 ES 细胞的小鼠，也有源于正常 ES 细胞的小鼠。嵌合体的杂交育种 对后代小鼠进行筛选，可以得到基因敲除的嵌合体小鼠。然后再经过杂交育种，按照孟德尔遗传规律，其后代中有 1/4 的几率为纯合子，这样经过将嵌合体小鼠和正常小鼠进行交配，就可以得到基因敲除的纯系小鼠，即基因敲除小鼠。在获得嵌合体小鼠后需要对其进行经行鉴定，验证是否为Scn5a+/-杂合型小鼠，采用剪去鼠尾尖，根据提取的基因组 DNA 进行判断。当替换型载体导入小鼠 ES 细胞，Scn5a 基因的 2 号外显子被 GFP 替换，即Scn5a 基因被敲除，待 ES 生长成小鼠后，与野生型小鼠相互杂交，产生三
9、种可能 Scn5a+/+, Scn5a+/-，Scn5a-/-。利用与基因组 2 号外显子外侧序列互补但是与载体不互补结合的上游引物，和与 2 号外显子互补结合的下游引物配对，和与重组载体互补结合的下游引物配对，PCR 检测发生同源重组的染色体，在 1000bp 和 600bp 左右位置分别有两条特异性条带，提示此小鼠基因组型别为Scn5a+/-。在获得上述 Scn5a+/-嵌合体小鼠后，通过分离其心肌细胞，比较嵌合体小鼠与野生型小鼠的纳电流，Scn5a+/-小鼠心肌细胞的 Nav1.5 通道电流较野生鼠明显减小，而通道的激活和失活没有改变，提示存在着 Nav1.5 通道表达运输的障碍。Scn
10、5a 基因敲除小鼠心脏传导系统功能障碍的电生理研究研究思路心肌快反应细胞（如心室肌细胞和心脏传导组织细胞）动作电位的上升支主要由 Nav1.5 通道激活产生，决定着心电冲动的传导。对 Nav1.5 通道的阻滞，可引起心脏电活动的异常。SCN5A 基因的突变或缺失目前所知可以引起 6 种心脏节律紊乱的疾病：Brugada 综合征，特发性心室颤动，非家族性易感性心律不齐，心脏传导系统疾病和病态窦房结综合征。上述疾病主要是因为 Nav1.5 通道功能减弱导致 Nav1.5 电流减小。而 Nav1.5 通道 G1743R 突变则导致通道蛋白运输的障碍，因而细胞膜上通道蛋白数量减少，Nav1.5 电流减
11、小，产生Brugada 综合征。故 SCN5A 基因的突变或缺失，可以通过 Nav1.5 通道功能的改变，亦或由于 Nav1.5 通道蛋白运输和表达障碍，从而导致离子通道病的发生。本实验即验证上述存在的两种途径。通过以上转基因动物模型，对于钠通道在窦房结起搏活动中的作用有了更进一步的认识，同时也可以对钠通道障碍导致的离子通道病的发病机制进行深入、全面的研究。在这个实验中通过 Langendorff 系统灌流 Scn5a+/-小鼠离体心脏，以排除自主神经的影响。实验发现，Scn5a+/-组小鼠心率减慢，心率变异程度很大，从 150 次每分钟到 300 次每分钟不等，且出现 房室传导阻滞。而野生型
12、小鼠间的心率则基本在 300 到 350 次之间。且 Scn5a+/-小鼠组较对照组 P 波时间及 PR 间期明显延长。研究结果表明，Scn5a+/-小鼠心脏传导组织电生理表现与一些心脏传导组织疾病如病态窦房结综合征等临床表现相似。因此Scn5a+/-小鼠可以作为研究此类疾病的良好的动物模型。在这个研究中发现，Scn5a+/-小鼠与野生小鼠相比，窦房结细胞 Nav1.5 通道电流减少，但是激活和失活的通道功能并无改变。对 Scn5a+/-小鼠与野生小鼠窦房结区 Nav1.5 通道蛋白表达免疫荧光检测结果显示，Scn5a+/- 小鼠窦房结区 Nav1.5 通道蛋白表达降低。因此，Nav1.5 通道蛋白运输和表达障碍是导致Scn5a+/-小鼠 Nav1.5 通道电流减小，产生病态窦房结综合征的主要原因。对Nav1.5 通道蛋白表达和运输障碍的干预有助于一部分病态窦房结综合征患者的治疗。这个课题应用分子生物学，电生理的方法从细胞到转基因动物水平研究了 SCN5A 基因突变和缺失导致病态窦房结征的发病机制。首次发现三个 SCN5A 基因突变点导致病态窦房结综合征是由于 Nav1.5 通道动力学发生改变致通道功能减弱，而不是通道蛋白质的转运障碍。首次阐明 Nav1.5 通道蛋白运输和表达障碍是导致 Scn5a+/-小鼠 Nav1.5 通道电流减小，产生病态窦房结综合征的主要原因。个人观点
