1、 第 29 卷 第 1 期2008 年 1 月 武 汉 大 学 学 报 (医 学 版 )Medical Journal of Wuhan University Vol. 29 No. 1Jan , 2008课 题 来 源 :湖 北 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (编 号 :2004ABA177) ;武 汉 市 青 年 科 技 晨 光 计 划 资 助 项 目 (编 号 :20055003059215)作 者 简 介 :陈 明 锴 ,男 ,19742 ,医 学 博 士 ,副 教 授 ,主 要 从 事 胃 肠 动 力 学 研 究单 个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 的 分 离 及 其
2、细 胞 膜 离 子 通 道 检 测陈 明 锴 罗 和 生武 汉 大 学 人 民 医 院 消 化 内 科 湖 北 武 汉 430060摘 要 目 的 :建 立 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 的 分 离 及 离 子 通 道 检 测 方 法 ,为 胃 肠 道 动 力 性 疾 病 和 离 子 通 道 相 关 性 疾病 的 研 究 提 供 技 术 平 台 。 方 法 :酶 消 化 法 急 性 分 离 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 ,运 用 离 子 通 道 膜 片 钳 技 术 在 全 细 胞 模 式 下检 测 单 个 平 滑 肌 细 胞 膜 上 离 子 通 道 的 状 况 。 结 果 :用 酶 消 化
3、 法 急 性 分 离 可 获 得 细 胞 膜 完 整 生 物 活 性 状 态 良 好 的 单个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 ,该 细 胞 符 合 膜 片 钳 实 验 的 要 求 ;运 用 离 子 通 道 膜 片 钳 技 术 在 全 细 胞 模 式 下 可 以 记 录 基 础 状态 和 干 预 后 单 个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 细 胞 膜 上 离 子 通 道 的 开 放 状 况 ,可 用 于 相 关 的 病 理 、 生 理 、 药 理 研 究 。 结 论 :酶消 化 急 性 分 离 法 是 获 得 单 个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 的 一 种 简 单 、 有 效 、 易 操
4、作 的 方 法 ,运 用 该 方 法 结 合 离 子 通 道 膜 片 钳技 术 可 以 准 确 记 录 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 细 胞 膜 上 离 子 通 道 的 开 放 状 况 。关 键 词 平 滑 肌 细 胞 ; 离 子 通 道 ; 膜 片 钳 技 术中 图 分 类 号 R573. 9 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 167128852 (2008) 0120009204Dissociation of Single Gastrointestinal Tract Smooth Muscle Celland Detection of Its Cellular Membrane
5、Ion ChannelCHEN Mingkai , L UO HeshengDept. of Gast roenterolog y , Renmi n Hos pital of W uhan U ni versit y , W uhan 430060 , Chi naAbstractObjective : To establish a series of convenient methods for dissociating single gastrointestinaltract smoot h muscle cell and detecting it s cellular membrane
6、 ion channel. Methods : Single gastro2intestinal tract smoot h muscle cell was dissociated f rom muscle strip s by using collagenase. Cellu2lar membrane ion channel were detected by patch clamp technique under t he whole2cell recordingmode. Results : The single gastrointestinal tract smoot h muscle
7、cell which was dissociated by col2lagenase can maintain it s p hysiological f unctions , and it can be used in patch clamp experiment s.By using patch clamp technique , cellular membrane ion channel could be detected facilely.Conclusion : Dissociation by using collagenase is a convenient and reliabl
8、e met hod to obtain singlegastrointestinal tract smooth muscle cell , and patch clamp technique can be used to detect gastro2intestinal tract smoot h muscle cell cellular membrane ion channel p unct ually.Key Words Smoot h Muscle Cell ; Ion Channel ; Patch Clamp Technique胃 肠 道 运 动 是 一 个 十 分 复 杂 的 过
9、程 ,它 受 到 神经 和 体 液 的 调 节 。 近 年 来 ,消 化 系 统 动 力 障 碍 性 疾病 的 研 究 逐 步 成 为 学 者 关 注 的 热 点 。 我 国 存 在 着 大量 消 化 系 统 动 力 障 碍 性 疾 病 的 患 者 ,而 国 内 有 关 消武 汉 大 学 学 报 (医 学 版 ) 第 29 卷化 系 统 动 力 障 碍 性 疾 病 的 相 关 基 础 研 究 却 起 步 较晚 ,实 验 技 术 相 对 落 后 ,因 此 有 必 要 创 建 一 些 简 便 易行 的 实 验 方 法 为 消 化 系 统 动 力 障 碍 性 疾 病 的 深 入 研究 提 供 技 术
10、 平 台 1 。1 材 料 与 方 法1. 1 试 剂 和 仪 器 H EPES、 NaCl、 KCl、 CaCl2 、MgCl2 、 葡 萄 糖 等 药 品 均 购 自 美 国 Sigma 公 司 , 型胶 原 酶 购 自 美 国 Wort hington Biochemical 公 司 。美 国 Axon Instrument 公 司 Axopatch12D 膜 片 钳 放大 器 和 Digdata1200 模 2数 / 数 2模 转 换 器 , 日 本Olymp us公 司 IX70 倒 置 显 微 镜 ,德 国 List Electron2ics 公 司 L/ M2sp s28 型 8
11、 通 道 灌 流 系 统 , 法 国 Milli2pore 公 司 Milli2Q Plus 纯 水 机 ,瑞 士 Mettler Toledo公 司 AB2104 电 子 天 平 ,美 国 Eutech Cybernetics 公司 p H 计 。1. 2 溶 液 台 氏 液 ( mmol/ L ) : NaCl 147 , KCl 4 ,CaCl2 2 ,Na H2 PO4 0. 42 , Na2 HPO4 2 , MgCl2 1. 05 ,Glucose 5. 5 ,以 NaO H 调 p H7. 4 ; PSS ( mmol/ L ) :NaCl 134. 8 , KCl 4. 5 ,
12、 H EPES 10 ,MgCl2 1 , Glucose10 ,CaCl2 2 , 以 Tris 调 p H7. 4。 钙 通 道 电 极 内 液(mmol/ L) : CsCl 135 , MgCl2 4 , H EPES 10 , Na2A TP 2 , EGTA 10 , TEA 20 , 以 Tris2Base 调 p H7. 4。 IK(Ca) 电 极 内 液 ( mmol/ L ) :天 冬 氨 酸 110 , Mg2A TP 5 , H EPES 5 ,MgCl2 1 , KCl 20 , EGTA 0. 1 ,di2tris2creatine p hosp hate 2. 5
13、 , di2sodium2creatinep hosp hate 2. 5 ,以 KO H 调 p H7. 4。 IK(V) 电 极 内 液(mmol/ L) :天 冬 氨 酸 110 , Mg2A TP 5 , H EPES 5 ,MgCl2 1 , KCl 20 ,EGTA 10 ,CdCl2 1 ,di2tris2creatinep hosp hate 2. 5 , di2sodium2creatine p hosp hate 2. 5 ,以 KO H 调 p H7. 4。1. 3 胃 窦 平 滑 肌 细 胞 的 分 离 取 EW G/ B 豚 鼠 ,体重 2502350 g ,雌 雄
14、不 拘 ,于 实 验 前 24 h 禁 食 ,12 h 禁水 。 将 豚 鼠 击 头 致 昏 ,剪 开 颈 静 脉 放 血 后 ,平 放 于 实验 台 上 。 剪 开 皮 肤 及 腹 壁 ,暴 露 全 胃 ,剪 出 胃 窦 部 放入 氧 饱 和 的 台 氏 液 中 ,沿 胃 小 弯 侧 剪 开 胃 窦 部 并 漂洗 干 净 。 将 洗 净 的 胃 窦 移 至 氧 饱 和 的 无 钙 PSS 缓 冲液 中 ,将 其 展 开 并 用 细 针 固 定 在 硅 胶 板 上 。 小 心 剪除 黏 膜 层 后 即 可 暴 露 出 环 行 肌 层 ,沿 环 行 肌 走 行 方向 用 弯 刃 弹 簧 剪 剪
15、取 1 mm 4 mm 长 的 环 行 肌 条9210 条 ,将 肌 条 放 入 台 氏 液 中 置 于 4 冰 箱 中 保 存15 min 左 右 。 消 化 液 含 1 % 型 胶 原 酶 、 0. 05 %胰蛋 白 酶 抑 制 剂 、 0. 05 %二 硫 苏 醇 糖 及 0. 2 %牛 血 清 白蛋 白 ,使 用 前 现 配 。 将 肌 条 放 入 酶 消 化 液 中 ,在 36236. 5 的 恒 温 水 浴 中 25235 min。 酶 解 完 毕 后 ,用 无钙 PSS 漂 洗 数 次 ,并 于 4 的 台 式 液 中 保 存 。 实 验前 用 吸 管 反 复 吹 打 直 至 液
16、 体 变 浑 浊 ,取 上 清 液 即 可得 单 个 豚 鼠 结 肠 平 滑 肌 细 胞 。1. 4 结 肠 平 滑 肌 细 胞 的 分 离 取 EW G/ B 豚 鼠 ,体重 2502350 g ,雌 雄 不 拘 ,于 实 验 前 24 h 禁 食 ,12 h 禁水 。 击 枕 处 死 动 物 ,剪 开 腹 腔 ,取 近 端 结 肠 约 5 cm ,在 氧 饱 和 台 氏 液 中 小 心 洗 净 肠 内 容 物 ,沿 纵 轴 剖 开 ,将 结 肠 固 定 于 硅 胶 板 上 。 在 解 剖 显 微 镜 下 小 心 地 分离 黏 膜 层 和 浆 膜 层 得 到 肌 条 。 将 肌 条 剪 成
17、2 mm 4mm 小 块 ,4 台 氏 液 保 存 10 min。 用 含 1 % 型 胶原 酶 、 1 %胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 、 2 %牛 血 清 白 蛋 白 的 消 化液 于 37 消 化 15 min 左 右 ,再 用 无 钙 台 氏 液 冲 洗 3次 ,洗 净 消 化 酶 后 置 于 4 冰 箱 备 用 ,实 验 前 用 吸 管反 复 吹 打 直 至 液 体 变 浑 浊 ,取 上 清 液 即 可 得 单 个 豚鼠 结 肠 平 滑 肌 细 胞 。1. 5 IK( Ca) 和 IK( V) 的 记 录 取 细 胞 悬 浮 液 约 0. 1 ml接 种 于 细 胞 灌 流 槽 中 ,
18、放 置 20 min 使 细 胞 自 然 沉降 、 贴 壁 , PSS 灌 流 。 用 电 极 内 液 充 灌 玻 璃 微 电 极 ,在 倒 置 显 微 镜 下 通 过 微 操 纵 器 调 节 电 极 封 接 细 胞 。当 细 胞 膜 与 玻 璃 微 电 极 形 成 高 阻 封 接 (封 接 电 阻 1 G ) 后 电 击 破 细 胞 膜 ,然 后 用 PSS 灌 流 ,以 - 60mV 为 钳 制 电 压 钳 制 细 胞 ,20 mV 为 阶 跃 ,检 测 IK(Ca)和 IK(V) 。1. 6 L 型 钙 通 道 的 记 录 将 0. 1 ml 细 胞 悬 浮 液 接种 于 灌 流 槽 中
19、 ,放 置 20 min 使 之 沉 降 、 贴 壁 ,以 Ba2 +做 为 载 流 子 检 测 钙 通 道 。 用 含 10 mmol/ L Ba2 + 的PSS 灌 流 。 在 倒 置 显 微 镜 下 通 过 微 操 纵 器 调 节 电 极封 接 细 胞 。 当 细 胞 膜 与 玻 璃 微 电 极 形 成 高 阻 封 接 (封接 电 阻 1 G )后 电 击 破 膜 ,用 PSS灌 流 ,以 - 80 mV为 钳 制 电 压 钳 制 细 胞 ,20 mV 为 阶 跃 ,检 测 IBa 。2 结 果2. 1 消 化 道 平 滑 肌 细 胞 的 分 离 参 考 国 外 相 关 文献 资 料 2
20、25 ,通 过 改 进 和 简 化 肌 条 的 分 离 方 法 ,调 整消 化 液 的 配 方 比 例 以 及 选 择 适 当 的 消 化 时 间 、 p H 值等 相 关 参 数 ,按 照 图 1 所 示 的 操 作 模 式 进 行 分 离 。运 用 上 述 方 法 可 以 得 到 细 胞 膜 完 整 、 生 物 活 性 状 态良 好 的 单 个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 ,光 镜 下 表 现 为 外 观具 有 很 强 立 体 感 ,表 面 光 滑 ,细 胞 质 内 无 颗 粒 状 物质 ,边 界 清 楚 ,外 缘 有 光 环 和 良 好 的 折 光 性 ,见 图 2。后 续 膜 片
21、钳 实 验 表 明 急 性 酶 消 化 分 离 法 得 到 的 消 化道 平 滑 肌 细 胞 完 全 能 够 满 足 离 子 通 道 检 测 的 需 要 。01第 1 期 陈 明 锴 ,等 .单 个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 的 分 离 及 其 细 胞 膜 离 子 通 道 检 测图 1 消 化 道 平 滑 肌 细 胞 分 离 示 意 图Fig. 1 Sketch map of gastrointestinal tract smooth muscle cell dissociation图 2 分 离 的 单 个 消 化 道 平 滑 肌 细 胞Fig. 2 Single gastrointe
22、stinal tract smooth muscle cell2. 2 消 化 道 平 滑 肌 细 胞 细 胞 膜 离 子 通 道 检 测 参考 国 外 文 献 以 及 有 关 心 肌 、 血 管 平 滑 肌 细 胞 离 子 通道 的 记 录 方 法 ,结 合 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 离 子 通 道 的特 点 摸 索 出 如 下 记 录 方 法 和 参 数 629 :2. 2. 1 延 迟 整 流 钾 通 道 膜 电 位 钳 制 在 - 60 mV ,电 极 内 液 按 前 述 配 方 , 以 每 10 s 的 时 间 间 隔 给 予 20mV 的 阶 跃 刺 激 使 细 胞 膜 电
23、位 从 - 40 mV 去 极 化 到+ 100 mV ,持 续 时 间 440 ms ,记 录 出 电 压 依 赖 性 外向 性 延 迟 整 流 钾 电 流 (图 3a) 。2. 2. 2 钙 激 活 钾 通 道 膜 电 位 钳 制 在 - 60 mV ,电极 内 液 按 前 述 配 方 , 以 每 10 s 的 时 间 间 隔 给 予 20mV 的 阶 跃 刺 激 使 细 胞 膜 电 位 从 - 40 mV 去 极 化 到+ 100 mV ,持 续 时 间 440 ms ,记 录 出 外 向 性 钙 激 活钾 电 流 (图 3b) 。2. 2. 3 L2型 钙 通 道 膜 电 位 钳 制
24、在 - 80 mV ,电 极内 液 按 前 述 配 方 , 以 每 10 s 的 时 间 间 隔 给 予 20 mV的 阶 跃 刺 激 使 细 胞 膜 电 位 从 - 60 mV 去 极 化 到 + 80mV ,持 续 时 间 600 ms ,记 录 出 内 向 性 L 型 钙 电 流(图 3c) 。3 讨 论在 众 多 的 消 化 系 统 疾 病 中 ,胃 肠 道 运 动 障 碍 性疾 病 越 来 越 引 起 人 们 的 重 视 。 在 消 化 内 科 门 诊 接 诊患 者 中 有 大 约 50 %的 患 者 存 在 胃 肠 道 运 动 障 碍 相 关图 3a 延 迟 整 流 钾 通 道 电
25、 流Fig. 3a Delayed2rectif ier potassium channel current图 3b 钙 激 活 钾 通 道 电 流Fig. 3b Calcium2activated potassium channel current图 3c L2型 钙 通 道 电 流Fig. 3c L2type calcium channel current的 症 状 10 。 近 10 多 年 来 ,国 内 外 学 者 在 胃 肠 道 运 动调 控 机 制 、 胃 肠 道 功 能 检 测 方 法 及 胃 肠 道 动 力 相 关药 物 开 发 方 面 都 取 得 了 许 多 重 大 进 展
26、,为 胃 肠 道 运动 障 碍 性 疾 病 的 研 究 打 下 了 坚 实 的 基 础 。 我 国 胃 肠道 运 动 障 碍 性 疾 病 的 发 病 率 较 高 ,但 国 内 有 关 消 化系 统 动 力 障 碍 性 疾 病 的 基 础 研 究 却 起 步 较 晚 ,实 验技 术 相 对 落 后 ,因 此 有 必 要 创 建 一 些 简 便 易 行 的 实11武 汉 大 学 学 报 (医 学 版 ) 第 29 卷验 方 法 为 消 化 系 统 动 力 障 碍 性 疾 病 的 深 入 研 究 提 供技 术 平 台 。消 化 道 平 滑 肌 具 有 自 动 节 律 性 ,有 较 大 的 伸 展性
27、,对 化 学 物 质 、 温 度 改 变 及 牵 张 刺 激 较 为 敏 感 等 一般 生 理 特 性 。 电 位 变 化 方 面 ,消 化 道 平 滑 肌 除 了 具有 一 般 可 兴 奋 组 织 的 静 息 电 位 和 动 作 电 位 ,还 有 其特 有 的 慢 波 电 位 11 。 胃 肠 道 的 运 动 来 源 于 平 滑 肌收 缩 ,平 滑 肌 细 胞 膜 去 极 化 达 到 一 定 阈 值 即 诱 发 动作 电 位 ,引 起 平 滑 肌 收 缩 。 其 机 制 为 :细 胞 外 Ca2 +内 流 产 生 内 向 电 流 ,导 致 平 滑 肌 细 胞 膜 去 极 化 ,从 而形 成
28、动 作 电 位 升 支 ,同 时 激 活 细 胞 内 K+ 外 流 形 成 外向 电 流 ,使 膜 逐 渐 复 极 化 至 静 息 电 位 。 神 经 递 质 和胃 肠 道 激 素 通 过 受 体 和 第 二 信 使 系 统 作 用 于 这 些 离子 通 道 ,从 而 对 胃 肠 道 平 滑 肌 电 生 理 和 收 缩 活 性 进行 调 节 12 。 因 此 ,对 单 个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 离 子 通道 开 放 状 态 的 研 究 在 胃 肠 道 运 动 障 碍 性 疾 病 的 基 础研 究 中 占 有 相 当 重 要 的 地 位 。本 研 究 在 大 量 阅 读 和 重 复 国
29、 外 相 关 文 献 的 基 础上 ,通 过 改 良 ,摸 索 出 一 套 分 离 胃 肠 道 平 滑 肌 单 细 胞及 其 细 胞 膜 离 子 通 道 检 测 方 法 。 研 究 表 明 ,通 过 急性 酶 消 化 分 离 法 可 以 得 到 细 胞 膜 完 整 、 生 物 活 性 状态 良 好 的 单 个 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 ,该 细 胞 可 以 满 足胃 肠 道 运 动 相 关 的 各 种 研 究 。 利 用 上 述 分 离 的 细胞 ,运 用 离 子 通 道 膜 片 钳 技 术 可 以 在 全 细 胞 模 式 下准 确 记 录 到 胃 肠 道 平 滑 肌 细 胞 膜 上 多
30、 种 离 子 通 道 的电 流 ,从 而 反 映 其 在 相 应 条 件 下 的 开 放 状 态 。 上 述研 究 方 法 简 单 、 易 行 、 可 重 复 性 好 ,将 为 消 化 系 统 动力 障 碍 性 疾 病 的 深 入 研 究 提 供 理 想 技 术 平 台 。参 考 文 献1 周 吕 ,柯 美 云 . 神 经 胃 肠 病 学 与 动 力 基 础 与 临 床 M .北 京 :科 学 出 版 社 ,2005.2 Wamhoff BR , Bowles D K , Owens GK. Excitation2transcription coupling in arterial smoot
31、h muscle J .Circ Res , 2006 ,98 :8682878.3 陈 明 锴 ,罗 和 生 ,余 保 平 . 黄 连 素 对 豚 鼠 结 肠 平 滑 肌 细胞 钾 通 道 的 影 响 J .中 华 消 化 杂 志 ,2003 ,23 :6892690.4 Sanders KM , Ozaki H. Excitation2contraction couplingin gastrointestinal smooth muscles. In : Laszlo S , J ul2ius GP , eds. Pharmacology of smooth muscle M .Berli
32、n : Springer2Verlag , 1998 , 3312390.5 Xu L , Chen J , Yu B , et al. Effect of progesterone oncalcium activated potassium currents and intracellularcalcium in guinea pig colon myocytesJ . Methods FindExp Clin Pharmacol , 2005 , 27 :475282.6 Tammaro P , Smith AL , Crowley BL , et al. Modula2tion of t
33、he voltage2dependent K+ current by intracellu2lar Mg2 + in rat aortic smooth muscle cells J . Cardio2vasc Res , 2005 ,65 :3872396.7 Kajioka S , Nakayama S , McCoy R , et al. Inward cur2rent oscillation underlying tonic contraction caused viaETA receptors in pig detrusor smooth muscleJ . AmJ Physiol
34、Renal Physiol , 2004 , 286 : 77285.8 Wellman GC , Nelson M T. Signaling between SR andplasmalemma in smooth muscle : sparks and the activa2tion of Ca2 + 2sensitive ion channels J . Cell Calcium ,2003 ,34 :2112229.9 Prasad M , Goyal R K. Monochloramine selectively in2hibits the transient outward pota
35、ssium current in colon2ic smooth muscleJ . Surgery , 2003 ,134 :3192328.10 莫 剑 忠 ,袁 耀 宗 ,邹 多 武 . 消 化 系 功 能 性 和 动 力 障 碍 性疾 病 M . 上 海 :上 海 科 技 出 版 社 ,2005.11 刘 劲 松 ,侯 晓 华 . 激 素 与 胃 肠 道 运 动 J .胃 肠 病 学 和 肝病 学 杂 志 ,2004 ,13 :3352336.12 Bolton TB , Prestwich SA , Zholos AV , et al. Excita2tion2contraction coupling in gastrointestinal and othersmooth muscles J . Annu Rev Physiol , 1999 , 61 : 852115.(2007203214 收 稿 )编 辑 张 峻21
