1、免疫组化入门实验操作一、实验目的：1. 了解免疫组化基本原理。2. 了解免疫组化实验操作及注意事项。3. 免疫组化结果判定。通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。二、实验原理：三、实验材料：一抗：CD5、CK8、Ki67二抗： MaxVision3其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS 缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。四、实验步骤：1. 脱蜡水化二甲苯 5min，二甲苯 5min，二甲苯 5min，无水乙醇 2
2、min，无水乙醇2min，95%酒精 2min，85%酒精 2min，自来水冲洗。2. 抗原修复高压锅中加入 1200mL 柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至 800W，至压力阀均匀喷气后计时 1.5min，移开高压锅室温冷却 10min，自来水冷却。3. 过氧化物酶阻断修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织 3mm 处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加 50 L（一滴） 过氧化物酶阻断剂，室温孵育 10min，PBS 冲洗 33min。4. 一抗甩去 PBS，纸巾擦干组织 3mm 外的残留液体，每张切片加 50 L（一滴）相应一抗，室温下孵育 6
3、0 分钟，PBS 冲洗 33min。5. 二抗甩去 PBS，纸巾擦干组织 3mm 外的残留液体，每张切片加 50 L（一滴）MaxVisionTM 试剂，室温下孵育 30 分钟，PBS 冲洗 33min。6. DAB甩去 PBS 液，纸巾擦干组织 3mm 外的残留液体，每张切片加 50 L（一滴）新鲜配制的 DAB，显色 5 分钟，自来水冲洗。7. 苏木素复染每张切片滴加 50 L（一滴）苏木素，20-30 秒后自来水冲洗 30s 以上，或浸泡于 PBS 中 30s 以上再自来水冲洗。8. 封片梯度酒精脱水干燥（85%酒精 2min，95%酒精 2min，无水乙醇 2min，无水乙醇 2min
4、，二甲苯 1min） ，或直接电吹风吹干，中性树胶封固。修复方法一、 柠檬酸缓冲液高温高压修复法取一定量 pH=6.0 柠檬酸盐缓冲液（ 800-1500ml）于压力锅中，大火加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片至于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上锅盖，扣上压力阀，将功率调至 800W,继续加热至喷气，从喷气开始计时，1.5 分钟后，压力锅离开热源，室温冷却 10 分钟后用自来水冲淋高压锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净。注意事项：1、加热时间长短（1.5 分钟）和加热功率（800W）的控制很重要，时间过短可能会使染色强度变浅，时间过长可能会使染色背景加深。2、
5、必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液 pH 值增高而导致掉片。3、高压锅离开热源后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。4、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。5、缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到。二、 EDTA 水煮修复法取 500mlEDTA 抗原修复液于 1000ml 不锈钢锅中，加热至沸腾，将电磁炉功率调至保温状态（120W） ，使修复液保持微沸状态。将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，再将染色架缓慢放入不锈钢锅中（注意：若快速放入可能会导致组织脱落） ，之后加盖继续加热 20 分钟。再将不锈钢锅从电磁炉上移开，室温冷却 10 分钟后用自来水冲淋不锈钢锅外壁加速
6、冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净，除去自来水，在离组织 3mm 处用免疫组化油笔画圈，PBS 冲洗 2 次，每次 3 分钟。注意事项：1、加热时间长短（20 分钟）和加热功率（120W）的控制很重要2、修复液不能重复使用。3、工作液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内。4、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。5、抗原修复后一定要等修复液冷却后，才能将切片取出。石蜡切片制作和 HE 染色一、目的要求：简要介绍石蜡切片的制作和苏木精、 曙红染色法（简称 H.E染色法），借以了解石蜡切片制作的基本原理和一般方法。二、实验用具：解剖器一套、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、
7、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、滤纸、熔蜡箱（或恒温箱）、展片台（或烫板）、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。三、实验材料：蛙或小白鼠。四、实验内容： （一）药品：、酒精及无水酒精：以下的各级浓度酒精是用酒精加蒸馏水稀释而成。简单的稀释方法：所需稀释的浓度是多少，就量取多少毫升原浓度的酒精，再加蒸馏水至该酒精的原浓度即可。例如，配制酒精，就量取ml酒精，然后加入ml 蒸馏水即成。、固定液：常用的固定液有福尔马林、Bouin 氏液和 Zenker 氏液等。Bouin氏液在组织学切片技术方面应用甚广，配方如下：苦味酸饱和水溶液 ml福尔马林 ml冰醋酸 ml、蛋白甘油：蛋白甘油是粘贴蜡
8、片用的粘片剂。配方如下：取一新鲜鸡蛋的蛋白，充分搅拌成雪花状泡沫，然后滤去泡沫，加入等量甘油，搅拌均匀，再加入一小粒麝香草酚防腐。、染色液：以 H.E.染色法为例，需配制苏木精染液和曙红染液。、苏木精染液：苏木精是一种碱性染料，它可将染色质染成蓝紫色。配方有多种，现介绍 Harris 氏苏木精的配制：甲液： 苏木精 . g酒精 . ml乙液： 硫酸铝钾（或硫酸铝铵） g蒸馏水 ml氧化汞 .g冰醋酸 几滴先将甲液溶解，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，并加热使溶解，然后将两液混合煮沸，离开火焰后缓缓加入氧化汞。冷却后过滤，加入几滴冰醋酸即成。、.曙红酒精溶液：即.g 曙红溶于ml酒精中。曙红是一种酸性
9、染料，它可使多种细胞的细胞质染成粉红色或红色。、盐酸酒精：盐酸酒精用于分色。配制方法是在ml酒精中加入ml 盐酸。、其它：二甲苯、切片石蜡、中性树胶等。（二）、操作步骤：进行组织学研究，必须把活的组织或器官制作成切片标本，以便在显微镜下进行观察。切片标本也就是利用组织的不同结构，经过染色后呈现出不同的颜色和不同的折光率而制作的。制片的方法众多，但基本要求是尽量保持结构的真相，切成薄的切片，应用不同的染色方法，使内部结构清晰易见。石蜡切片法是最常用的一种制片法。其制作过程是：取材固定冲洗脱水透明浸蜡包埋切片贴片烤片脱蜡复水染色脱水透明封藏。现分述如下：、取材和固定：固定的目的在于保存组织内细胞原
10、有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。把动物杀死后应立即割取组织块，并快速投入固定液中。将蛙或小白鼠快速剪去头部，打开腹腔，用锐利的刀片割取小块组织（肝、肠等）。 组织块的大小以厚度不超过mm 为宜。 然后， 将取下的组织块迅速投入 Bouin 氏固定液中。固定时间为数小时至小时（需视组织块的大小而定）。、冲洗：经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色.用 Bouin 氏液固定的材料,可直接移入 70酒精中，多换几次酒精，直至无黄色时为止。也可在酒精中加入几滴氨水或饱和碳酸锂溶液，以迅速洗去黄色。但留少许黄色也无
11、妨碍。浸洗后的材料若暂时不制片，可保存于酒精中。、脱水：柔软并含有多量水分的组织是易切成薄片的，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经酒精酒精酒精（）酒精（）无水酒精（）无水酒精（），各级酒精小时。脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。、透明：酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利
12、石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。将脱水后的材料经：无水酒精与二甲苯二甲苯（）二甲苯（），各级时间为.小时，务使组织达到透明为止。、浸蜡：将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切片。先将装有石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定（约），切勿太高或太低。 然后将透明了的材料放入蜡杯（）蜡杯（）蜡杯（）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为小时左右。、包埋：将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。包埋前，视组织块的大小先将绘图纸折成一纸盒，作为包埋的容器。纸
13、盒折法如下：先折、线，次折、线，然后使 a、b 两折重叠，向外折出线；同法折出线，再折 c 线。最后依同法折出、线及 d 线即成。将纸盒盛满已熔化的石蜡，随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。然后速将纸盒半浸于冷水中，待石蜡表面凝结后，将纸盒全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后，拆去纸盒即成蜡块。、切片：切片前，先将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正方形或长方形，否则切出的蜡带弯曲不直，或无法连成带状。将修整后的蜡块粘在小木块上，小木块装在切片机上，以待切片。在旋转式切片机上将蜡块切成um 厚的薄片。切下的薄片连。蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用。、贴片或烤片：将蜡
14、片粘贴在载玻片上即为贴片。用小玻棒蘸取一点蛋白甘油滴于一干净的载玻片上，用手指涂匀，并加几滴蒸馏水于载玻片上。 将蜡带按要求切成适当长度的蜡片，然后用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上，再把载玻片放在展片台上（温度为左右）。蜡片受热后即慢慢展平。待完全展平后，用解剖针将切片位置拨正，倾去载玻片上的余水后，将其放在烤片盒中，置于左右恒温箱内烤干。、染色：染色剂多为水溶液，故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。染色方法众多，以 H.E.染色法而言有下列步骤：、脱蜡：将烤干的切片放入二甲苯()二甲苯()中，各为min， 以溶去切片上的石蜡。、复水：是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程，即将二甲
15、苯()中取出的切片移入无水酒精酒精酒精酒精蒸馏水，各级中停留min。、染色：、将蒸馏水洗涤后的切片移入 Harris 苏木精液中min，使细胞核着色。、用自来水洗去切片上残余的染液。、用盐酸酒精分色数分钟。分色时就是褪去细胞质不应着色部分的颜色，而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片，使分色适度。、入氨水或自来水浸洗，使之蓝化。、在蒸馏水中浸片刻。、切片入各min。、入。曙红酒精溶液中染色min，使细胞质着色。、脱水：切片依次入酒精()酒精()无水酒精()无水酒精()，各级中停留min。、透明：切片入：无水酒精、二甲苯二甲苯()二甲苯()，各级停留min。、封藏：将切片从二甲苯
16、()中取出，用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶，然后，用镊子加盖盖玻片。切片封好后，放在切片托盘上待干燥，即可用不观察。染色结果：细胞核呈现鲜艳的蓝色，细胞质及细胞间质呈粉红至红色。（三）、注意事项：、制片是一个连续的操作过程，往往要连续几天才能完成，因此，事先一定要制订工作日程计划，应按顺序进行工作。这样可避免和其它工作发生冲突，也不会因前后顺序颠到或超过了规定的时间，给工作带来不必要的损失。、制片的各个步骤都是互相关联的，如脱水不彻底就会影响到透明的程度，以至影响蜡块的质量。为此，必须对任何一个步骤，都要细致、严格进行操作。、通过本实验可了解到每张切片都是来之不易的，因此，应倍加爱护，不要损坏。
