制药分离工程实验指导定稿.doc

1、 制药分离工程实验指导四川理工学院制药分离工程实验指导第一版制药工程系 编二一二 年制药分离工程试验 目录目 录实验一 细胞 SOD 的提取和分离 .- 1 -实验二 大枣中多糖的提取分离 3实验三 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶 5实验四 柱层析法对色素的提取与分离 7实验五 质粒的提取及电泳分离 9实验六 八角茴香油的提取与检识 11实验七 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定 14实验八 大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷 16实验九 重结晶及过滤 18实验十 简单蒸馏及分馏 3制药分离工程实验 细胞 SOD 的提取和分离实验一 细胞 SOD 的提取和分离一、实验目的 1 掌 握 有 机 溶

2、 剂 沉 淀 法 的 原 理 和 基 本 操 作 。2 掌 握 SOD 酶 提 取 分 离 的 一 般 步 骤 。二、实验原理超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase， SOD)是 一 种 具 有 抗 氧 化 、 抗 衰 老 、抗 辐 射 和 消 炎 作 用 的 药 用 酶 。 它 可 催 化 超 氧 负 离 子 (O2-)进 行 歧 化 反 应 ， 生 成 氧和 过 氧 化 氢 。 大 蒜 蒜 瓣 和 悬 浮 培 养 的 大 蒜 细 胞 中 含 有 较 丰 富 的 SOD， 通 过 组 织或 细 胞 破 碎 后 ， 可 用 pH7.8 的 磷 酸 缓 冲 溶 液

3、 提 取 出 来 。 由 于 SOD 不 溶 于 丙 酮 ，可 用 丙 酮 将 其 沉 淀 析 出 。有 机 溶 剂 沉 淀 的 原 理 是 有 机 溶 剂 能 降 低 水 溶 液 的 介 电 常 数 ， 使 蛋 白 质 分 子 之 间的 静 电 引 力 增 大 。 同 时 ， 有 机 溶 剂 的 亲 水 性 比 溶 质 分 子 的 亲 水 性 强 ， 它 会 抢 夺 本 来与 亲 水 溶 质 结 合 的 自 由 水 ， 破 坏 其 表 面 的 水 化 膜 ， 导 致 溶 质 分 子 之 间 的 相 互 作 用 增大 而 发 生 聚 集 ， 从 而 沉 淀 析 出 。三、试剂与仪器1.试剂与材

4、料新鲜蒜瓣 、 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） 、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 、丙酮：用前需预冷至 4-10 、0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（pH10.2） 、0.1mol/LEDTA 溶液 、2mmol/L 肾上腺素溶液2. 仪器 恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒四、实验步骤1. 组织细胞破碎：称取 5g 大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。 2. SOD 的提取：破碎后的组织中加入 2-3 倍体积的 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） ，继续研磨 20min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后在 5000rpm 下离心 1

5、5min，取上清液。 3. 除杂蛋白：上清液加入 0.25 体积的氯仿-乙醇混合液搅拌 15min，5000rpm 离心15min，得到的上清液为粗酶液。 4. SOD 的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min，5000rpm 离心 15min，得SOD 沉淀。将 SOD 沉淀溶于 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）中，于 55-60热处理15min，得到 SOD 酶液。 5. SOD 活力测定 将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的 SOD 活力。 试剂 空白管 对照管 样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0EDTA 溶液 0.5 肾上腺素溶液 肾上腺素溶

6、液蒸馏水 0.5 0.5 -样品液 - - 0.5混合均匀，在 30水浴中预热 5min制药分离工程实验 细胞 SOD 的提取和分离肾上腺素溶液 0.5 0.5加入肾上腺素后，继续保温 2min，然后立即在 480nm 处测定光密度。对照管和样品管的光密度值分别为 A 和 B。 在上述条件下，SOD 抑制肾上腺素自氧化 50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 酶活力（单位）=2（A-B）N/A 式中，N样品稀释倍数；2抑制肾上腺素自氧化 50%的换算系数。 五、实验结果 根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。 六、注意事项1. 酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在

7、冰浴中研磨，在低温中离心。 2. 肾上腺素容易被氧化，故操作时要尽量快。 以对单糖混合液进行分离。以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系七 、 思 考 题1.计 算 出 每 500g 大 蒜 蒜 瓣 所 制 备 出 的 SOD 酶 的 克 数 。2.讨 论 有 机 溶 剂 沉 淀 法 与 盐 析 法 相 比 的 优 缺 点 。制药分离工程实验 大枣中多糖的提取分离实验二

8、大枣中多糖的提取分离一 、实验目的1、学习多糖的提取分离方法及工艺2、熟悉萃取、离心、蒸发、干燥等单元操作3、掌握苯酚硫酸法鉴定多糖的方法。二 、实验原理多糖化合物作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞提高机体的免疫功能，对正常的细胞没有毒副作用，在临床上用来治疗恶性肿瘤、肝炎等疾病。大分子植物多糖如淀粉、纤维素等多不溶于水，且在医药制剂中仅用作辅料成分，无特异的生物活性。而目前所研究的多糖，因其分子量较小，多可溶于水，因其极性基团较多，故难溶于有机溶剂。多糖的提取方法通常有以下三种。(1)直接溶剂浸提法：这也是传统的方法，在我国已有几千年历史，如中药的煎煮、中草药有效成分的提取。该方法具有设备简

9、单、操作方便、适用面广等优点。但具有操作时间长、对不同成分的浸提速率分辨率不高、能耗较高等缺点。(2)索氏提取法：在有效成分提取方面曾经有过较为广泛的应用，其提取原理：在索氏提取中，基质总是浸泡在相对比较纯的溶剂中，目标成分在基质内、外的浓度梯度比较大；在回流提取中溶液处于沸腾状态，溶液与基质间的扰动加强，减少了基质表面流体膜的扩散阻力，根据费克扩散定律，由于固体颗粒内外浓度相差比较大，扩散速率较高，达到相同浓度所需时间较短，且由于每次提取液为新鲜溶剂，能提供较大的溶解能力，所以提取率较高。但索氏提取法溶剂每循环一次所需时间较长，不适合于高沸点溶剂。(3)新型提取方法：随着科学技术的发展，近年

10、出现了一些新的提取方法和新的设备，如超声波提取、微波提取以及与膜分离集成技术，极大地丰富了中草药药用成分提取理论。此外还有透析法、柱色谱法、分子筛分离法及中空纤维超滤法等。可根据原料及多糖的特点，设计不同的提取工艺。本实验采用直接溶剂浸提法提取大枣多糖。三 、试剂与仪器试剂：大枣，无水乙醇，浓硫酸，苯酚（常压蒸馏，收集 182馏分） ，蒸馏水。仪器：电热恒温水浴锅，磁力搅拌器，电子天平，真空干燥箱，低速离心机，旋转蒸发仪，家用多功能粉碎机；锥形瓶，量筒，容量瓶，试管，移液管，玻璃棒，烧杯、蒸馏头。四 、实验步骤(1)大枣多糖的提取制药分离工程实验 大枣中多糖的提取分离将大枣烘干，粉碎，称取枣粉

11、 15g，装入 250mL 的锥形瓶中，并加入 200mL 的蒸馏水。开动磁力搅拌器搅拌，在 80恒温水浴提取 1h。将大枣提取液离心，得到上清液，并定容于 200mL 容量瓶中，从中移取 10mL 于10mL 试管中，以备鉴定。剩余上清液 45在旋转蒸发仪减压浓缩至原提取溶液体积的 1/2，浓缩液中加220mL 无水乙醇，使溶液乙醇含量达到 70%，静置 2h 后离心分离，收集多糖沉淀，加入多糖沉淀 1 倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离后将沉淀物放入 45真空干燥箱，干燥至恒重得大枣粗多糖。提取率计算提取率=(干燥大枣粗多糖/原枣粉重量)100%(2)多糖的鉴定 5%苯酚溶液的配制：取苯酚 1

12、00g，加铝片 0.1g 和 NaHCO3 0.05g，蒸馏收集 182馏分，称取此馏分 25g，加水 475g，置于棕色瓶放入冰箱备用。 移取大枣多糖提取液三份各 2.5mL，标为 1 #，2#，3 #样，分别定容于50mL、100mL、200mL 容量瓶中。 分别移取 1 #，2#，3 #多糖溶液 1mL 于 10mL 试管中，然后依次加入 1.6mL 的 5%苯酚溶液，7mL 浓硫酸，振荡摇匀后室温冷却，观察溶液颜色变化。五、实验结果与讨论 记录试验条件、过程、各试剂用量及产品的重量，并计算大枣多糖的提取率，填写下表。产品为暗红色固体。观察大枣多糖鉴定过程中的溶液颜色变化，记录试验现象。

13、填写下表 1。 表 1 大枣中多糖的提取率及鉴定结果组别 多糖重量 提取率 溶液颜色变化1#2#3#六、思考题1与不同小组的实验结果进行比较，讨论影响多糖提取实验结果的因素都有哪些？制药分离工程实验 大枣中多糖的提取分离2结合糖的性质，分析采用苯酚一硫酸法鉴定大枣多糖的原理，并讨论溶液颜色与多糖含量的关系制药分离工程实验 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶实验三 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶一、 实验目的1 掌 握 有 机 溶 剂 沉 淀 法 的 原 理 和 基 本 操 作 。2掌握大豆脲提取分离的一般步骤。3.熟悉重结晶操作的方法。二、实验原理脲酶（EC3.5.6.5）广泛存在于微生物和动、植物组织中

14、，1926 年，Sumner J 曾用32的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并得到了结晶。该酶相对分子质量为 483 000，由6 个亚基组成，等电点 4.9,溶于水和稀缓冲液，粗酶较稳定，纯酶不太稳定，结晶酶在低温下可稳定 1 年以上。本实验用乙醇或丙酮从大豆种子中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点结合法制备该酶。三、仪器与试剂仪器：家用磨粉机、冰浴设备、离心机、5mL、10mL 、50mL 离心管、1.5mL 塑料离心管及其他常规仪器；试剂：新鲜大豆或大豆粉；人造移石（专用于吸附氨 Permutin 颗粒状人造沸石）; 2 醋酸：冰醋酸 2mL 用蒸馏水稀释至 l00mL ; 64和 32丙酮(丙

15、酮原液按体积百分比用蒸馏水配制)。四、实验步骤1.提取（1）称取 5g 人造沸石，置小烧杯中，用 2乙酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。（2）称取 10g 新鲜大豆粉，置入锥形瓶中，加上述人造浮石，加 50mL 32丙酮溶液，在冰浴中持续摇动 4min5min,4 层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加 10mL32丙酮，再提取一次。4 层纱布过滤，滤液在4，3500rmin - l条件下离心 8min10min ，小心倾出上清液，计量体积。取 lmL 酶液保存，供测酶活力和蛋白质用。2.沉淀脲酶在 32的丙酮中可以缓慢聚集而沉淀，但当酶液在等电点附近时，

16、沉淀生成更快。故：（1）将提取的酶液置冰浴中，在缓慢搅拌下，用点滴管逐滴滴加 2 醋酸，并不断用精密 pH 试纸检测 pH 变化，观察产生浑浊的现象，直至 pH4.9 左右。置 4 低温下过夜，可析出沉淀。制药分离工程实验 有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶（2）将沉淀物仔细转入预冷的离心管， 3500rmin - l条件下离心 10 min12min。上清液回收丙酮；沉淀即为脲酶粗品。风干后，称重，计算酶的收得率。3.重结晶（1）将所得粗酶溶于少许蒸馏水中，吸取 0.2mL0.4mL 用于测定酶活力和蛋白质，此即粗酶的活力。（2）酶溶液在冰浴中冷至 24，搅拌下缓慢滴入等体积 64的预冷丙酮溶液，保

17、持低温条件下让其缓慢析出结晶，需要较长的时间，可得到较好的正方形晶体。如果将溶液调至等电点结晶，则结晶速度较快，但晶形不够规整。结晶干燥后低温保存。五、结果计算酶收得率（%) = （酶干重酶干重 测酶活留取液体体积酶液总体积）样品重100% 酶的比活力Umg -1，( pr.) 总活力总蛋白质报告试验结果及观察到的有关现象记载。酶制备记录表如下：酶活力 蛋白质步骤总体积（mL）UmL-1总活力( U )mgmL-1总蛋白质（mg )比活力Umg-1 ( pr. )收得率( % )( l ）提取液( 2 ）粗酶( 3 ）结晶酶六、思考题1、脲酶提取过程中为什么要用人造沸石？2、脲酶提取过程中有二

18、次需要离心，每次离心的目的是什么？离心操作要注意些什么问题？3、制药分离工程实验 柱层析法对色素的提取与分离实验四 柱层析法对色素的提取与分离一、实验目的1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；2、了解柱层析和薄层色谱分离的基本原理，掌握柱层析和薄层色谱分离的操作技术。3、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。二、实验原理石油醚是一种脂溶性很强的有机溶剂。叶绿体中的四种色素在石油醚中的溶解度是不同的：溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。溶解度最高的是胡萝卜素，它随石油醚在滤纸上扩散得最快，叶黄素和叶绿素 a

19、的溶解度次之；叶绿素 b 的溶解度最低，扩散得最慢。这样，四种色素就在扩散过程中分离开来。同样，提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。本实验是用活性氧化铝作吸附剂，分离菠菜中胡萝卜素、叶黄素、叶绿素 a 和叶绿素 b。三、仪器与试剂 仪器：研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶(150ML 的 2 个)、色谱柱、抽滤瓶、铁架台、脱脂棉，723 分光光度计 ，烧杯（500ml 各 3 个），分液漏斗（250ml，1 个）试剂：硅胶 G ，碱

20、性三氧化二铝，石英砂，甲醇（500ml），石油醚（ 60-90 ，500ml），丙酮（500ml），乙酸乙酯（500ml），菠菜叶。四、实验步骤1、菠菜色素的提取 取 2g 新鲜菠菜叶，与 10mL 甲醇拌匀研磨 5 分钟，弃去滤液。残渣用 10mL 的石油醚-甲醇（3:2）混合液进行提取，共提取两次。合并液用水洗后弃去甲醇层，石油醚层进行干燥、浓缩。2、薄层层析将上述的浓缩液点在硅胶 G 的预制板上，分别用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）两种溶剂系统展开，经过显色后，进行观察并计算比移值。3、柱层析取 3g 中性氧化铝进行湿法装柱。填料装好后，从柱顶加入上述浓缩液，用石油醚

21、-丙酮（9:1）、石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）进行洗脱，依次接收个色素制药分离工程实验 柱层析法对色素的提取与分离带，即得胡萝卜素（橙黄色溶液）、叶黄素（黄色溶液）、叶绿素 a（蓝绿色溶液）以及叶绿素 b（黄绿色溶液）。称取 12g 碱性三氧化二铝加入 30mL 石油醚搅拌，浸泡 10min。在层析柱内加入一团棉花（棉花要尽量薄）在底部再加入 0.5cm 的石英砂，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再加入石英砂 0.5cm 高。样品的分离层析将浓缩液小心地从柱顶

22、部加入。加完后打开活塞，让液面下降到柱中砂层，关闭活塞，加几滴石油醚冲洗内壁，打开活塞，使液面下降如前，在柱顶小心加入约 1.52cm 高度的石油醚-丙酮洗脱剂，层析即开始进行。先用石油醚-丙酮（9:1）洗涤（配置约 50ml 的混合液即可），当黄色色带洗出后，改用石油醚-丙酮（7:3）（配置约 50ml 的混合液即可），继续洗涤。当第一个有色成分即将滴出时，另取一洁净的烧杯收集，得黄色溶液，即胡萝卜素。将洗脱剂换成 1：7 的石油醚-丙酮混合液，继续洗脱可得到第二色带的黄绿色溶液，即叶绿素 a 和叶黄素。五、思考题 1. 提取和分离叶绿体中色素的关键是什么？2. 叶绿体中有哪几种色素？滤纸条

23、上的色素带，从上到下是怎样排列的？3. 叶绿体中的色素含量最多和扩散速度最快的是哪一种？制药分离工程实验 质粒的提取及电泳分离实验五 质粒的提取及电泳分离一、实验目的1.掌握提取质粒的方法2.掌握凝胶电泳分离鉴定质粒 DNA 的方法。二、实验原理采用溶菌酶或 EDTA 可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）或 TritonX-100 处理后，细菌染色体 DNA 回缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体 DNA 比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体 DNA 变性，而共价闭合环状 DNA 的两条链不会相互分开，当外界

24、条件恢复正常时，线性染色体 DNA 片段难以复性，而是与变形的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒 DNA 双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。二、 仪器与试剂 1.仪器：冷冻高速离心机、恒温震荡摇床、蒸汽灭菌锅、恒温水浴、微量移液器。2.试剂：溶液 I：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.CL，10 mmol/L EDTA （Ph 8.0）溶液 II: 0.2 mol/L 氢氧化钠，1%SDS溶液 III：5 mol/L KAc 60mL, 冰醋酸 11.5mL, 去离子水 28.5mL，TE 缓冲液：10 mmol/L Tris.CL，1

25、mmol/L EDTA （Ph 8.0）饱和酚、氯仿、异戊醇、琼脂糖凝胶四、实验步骤1. 细菌培养挑单菌落接种到 5 mL 含有氨苄青霉素的培养基中 37振荡至对数生长后期。2. 细菌收集取 1.5 mL 培养液，4000 rpm 离心 5 分钟后倒掉上清液。3. 质粒提取1）加 100 L 预冷的溶液 I，涡旋悬浮后，在冰上放置 5 分钟。2）加 200 L 溶液 II，轻轻混匀后，冰上放置 5 分钟。3）加 150 L 溶液 III，充分混合后，冰上放置 5 分钟。4）4，10000 rpm 离心 15 分钟，把上清液移至新管。4. 抽提加等体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀，放置片刻。

26、4，10000rpm 离心 10 分钟，把上清液移至新管。制药分离工程实验 质粒的提取及电泳分离5. 质粒沉淀加入 2 倍体积的冰乙醇，放置 20 分钟。4，10000rpm 离心 15 分钟，倒弃上清。6. 洗涤沉淀加入 500 L，70%的乙醇，洗涤沉淀。7. 溶解质粒4, 7000 rpm 离心 5 分钟，倒弃上清，真空干燥，加入适量（20 L）的 TE 和 0.5L RNA 酶溶液。8. 制备凝胶称 1g 琼脂糖，放入 250 mL 三角瓶内，加入 100 mL 1TAE 电泳缓冲液，加热煮沸等其凉到 60左右，倒入封好的电泳板上。9. 上样1）吸取 2 L 质粒，加入 1L 上样缓冲

27、液（Loading buffer），混匀。2）将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中10. 电泳 连接好电泳槽和电泳仪，以 5V/cm 恒压电泳。11. 染色及脱色电泳 1.5-2 h 后，关上电泳仪。取出凝胶，放入染色槽内，加入 1 滴溴化乙锭（EB）轻轻摇荡 15 分钟。将染色液倒入储存桶内，在染色槽内加入自来水，轻轻摇荡 10 分钟。12. 结果观察 将凝胶放到紫外灯下观测。记录观察到的电泳条带。 五、思考题1.说明碱裂法提取质粒的原理?2.电泳结果出现几个条带?各是什么?制药分离工程实验 八角茴香油的提取与检识实验六 八角茴香油的提取与检识一、实验目的：1 掌握用水蒸汽蒸馏法提取挥发油的

28、原理和方法。2 学习挥发油的一般检识及挥发油中固体成分的分离方法。3 掌握挥发油中化学成分的薄层点滴定性检识。4 了解挥发油单向二次薄层层析法。二、实验原理：八角茴香为木兰科植物八角茴香的干燥成熟果实。内含挥发油约 5%。主要成分是茴香脑，约为总挥发油的 80-90%。此外，尚有少量甲基胡椒酚、茴香醛、茴香酸等。其主要化合物的结构式如下： OMeOMeOMeCHOOMeCOH茴香脑 甲基胡椒酚 茴香醛 茴香酸本实验是根据挥发油具有所属挥发性，能随水蒸汽一同蒸出的性质，选用水蒸汽蒸馏法进行提取。挥发油的组成成分比较复杂，常含有烷烃、烯烃、醇、醛、酮、酸、醚等。由于各类化合物都具有其牲官能团，因此

29、，可以用一些检出试剂在薄层板上进行点滴试验，从而了解挥发油各组分化合物的类型。挥发油各组分的极性各不相同，一般结构中不含氧的烃类和萜类化合物极性较小，在薄层层析时可以被石油醚较好的展开；而含氧的烃类和萜类化合物极性较大，不易被石油醚展开，但可被石油醚：乙酸乙酯的混合溶剂较好的展开。为了使挥发油中各组分能在一块薄层板上进行分离，可采用单向二次层析展开法。所谓单向二次展开，是先用极性稍大的展开剂进行第一次展开，当展开剂展至薄层板中部时，取出，立即挥去展开剂。此时，挥发油中极性小的成分被推至展开剂前沿，极性较大的成分已被展开分离。将原来的薄层板改换极性小的展开剂再作第二次展开，直至展开剂展开至薄层板

30、的顶端，此时可使极性小的成分在较小极性的展开剂中得到很好的分离，从而达到在一块薄层板上完成极性大小不同的多种成分分离的目的。所谓双向展开，其方法是用一块方形薄层板进行层析，第一次展开和第二次展开的方向互为 90，即用第一种展开剂先展开后，挥尽展开剂，将薄层板转换 90角，用第二种展开剂再展开一次，可使挥发油中的各组分得到分离。三、试剂与仪器仪器：圆底烧瓶，长颈圆底烧瓶，直形冷凝管，接液管，量筒，分液漏斗，锥形瓶，布氏漏斗，滤纸，抽滤瓶，电热套等，挥发油测定器，1010cm硅胶制药分离工程实验 八角茴香油的提取与检识CMCNa薄层板，毛细管。药品：八角茴香，乙醇，石油醚（3060沸程） ，乙酸乙

31、酯，香草醛，硫酸。四、实验步骤1 八角茴香油的水蒸汽蒸馏法：取八角茴香 50g，捣碎，置烧瓶中，加适量水浸泡湿润，按一般水蒸汽蒸馏法进行蒸馏。也可将捣碎的八角茴香置于挥发油测定器的烧瓶中，加蒸馏水 500mL 与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并使溢流入烧瓶时为止。缓缓加热至沸，至测定器中油量不再增加，停止加热，放冷，分取油层。2 分离固体成分：将所得的八角茴香油置冰箱中冷却 1 小时，即有白色结晶析出，趁冷过滤，压干。结晶主要为茴香脑，滤液为析出茴香脑后的八角茴香油。3 八角茴香油的检识：油斑试验：将八角茴香油 1 滴，滴于

32、滤纸片上，加热烘烤，观察油斑是否消失。薄层点滴反应：取硅胶 CMC-Na 薄层板 1 块，用铅笔在其上划线打格，形成如图所示的方格，进行类似磁点滴板的试验。先将挥发油样品用 5-10 倍量乙醇稀释后，以毛细管分别滴加于每个格内再将各种试剂用滴管分别滴于各挥发油样品的斑点上，观察颜色变化。所用挥发油除本次实验所提取的八角茴香油外，可同时用桂皮油、丁香油、薄荷油、桉叶油，松节油、樟脑油等进行观察。挥发油的薄层检识：单向二次展开：取 1 块长约 15cm 的硅胶 CMCNa 薄层板，在距底边 1.5cm 及 8cm处分别用铅笔画一起始线和中线。将八角茴香油溶于丙酮，用毛细管点于起始线上，用石油醚（3

33、060沸程）：乙酸乙酯85：15 的混合液为展开剂，展开至薄层板的中线处，取出，挥去展开剂后，再放入石油醚（3060沸程）中展开，至接近薄层板顶端时取出，挥去溶剂后立即显色。显色剂：分别用下列显色剂喷雾显色。显色剂 与挥发油显色情况1%香草醛60%硫酸溶液 紫色、红色等多种颜色荧光素溴试剂 黄色斑点示有不饱和化合物2,4 二硝基苯肼试剂 黄色斑点示有醛、酮化合物005%溴甲酚氯乙醇试剂 黄色斑点示有本性化合物双向展开：取 1010cm 硅胶 CMCNa 薄层板一块，沿起始线的右侧 1.5cm 处点样（只点 1 个原点） 。先在石油醚中做第一方向展开，待展开至接近薄层板的终点，取出薄层板，挥去溶

34、剂。再将薄层板调转 90，置于石油醚（3060）：乙酸乙酯（85：15）展开剂中做第二方向展开至接近薄层板终端，取出薄层板，挥去展开剂，同上法显色。根据结果分析挥发油组成情况。五、注意事项1 采用挥发油含量测定装置撮挥发油，可以初步了解该药材中挥发油的含量，但所用的药材量应使蒸出的挥发油量不少于 0.5mL 为宜。2 挥发油测定装置一般分为两种，一种为适用于相对密度小于 1.0 的挥发油。另一种用制药分离工程实验 八角茴香油的提取与检识于测定相对密度大于 1.0 的挥发油。 中华人民共和国药典95 版规定，测定相对密度大于 1.0 的挥发油，也在相对密度小于 1.0 的测定器中进行，可在加热前

35、，预先加入1mL 二甲苯于测定器中，然后进行水蒸汽蒸馏，使蒸出的相对密度大于 1.0 的挥发油溶于二甲苯中。由于二甲苯的相对密度为 0.8969，一般能使挥发油与二甲苯的混合溶液浮于水面。在计算挥发油的含量，扣除加入二甲苯的体积即可。3 提取完毕，须待油水完全分层后，再将油放出，注意尽量避免带出水分。4 起先挥发油单向二次展开层析时，一般先用极性较大的展开剂展开，然后再用极性较小的展开剂展开，所得的分离效果较好。在第一次展开后，应将展开剂完全挥去，再进行第二次展开，否则将影响第二次展开的极性，从而影响分离效果。5 挥发油易挥发逸失，因此进行层析检识时，操作应及时，不宜久放。6 溴甲酚绿试剂显色

36、时，应避免在本性条件下进行。七 、 思 考 题1、计算八角茴香中挥发油的含量。（计算公式：挥发油含量（ML/g）=挥发油体积/八角茴香重量100%）2、提取挥发油常用方法有哪几种？哪种方法较好，为什么？3、水蒸气蒸馏装置包括哪几部分？4、水蒸气蒸馏对被提纯物有何要求？制药分离工程实验 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定实验七 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定一、实验目的1. 掌握溶剂法提取分离七叶苷和七叶内酯的技能；2.掌握内酯类化合物的检识方法二、实验原理秦皮中含七叶苷和七叶内酯。七叶苷易溶于热水，可溶于乙醇，微溶于冷水，难溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿，在稀酸中可水解，水溶液

37、有兰色荧光；七叶内酯易溶于热乙醇和氢氧化钠溶液，可溶于乙醇、乙酸乙酯，几乎不溶于乙醚、氯仿。三、 试剂与仪器试剂：秦皮，无水乙醇，蒸馏水，氯仿，乙酸乙酯，无水硫酸钠，甲醇，氢氧化钠，三氯化铁，浓氨水，甲酸，甲酸乙酯，甲苯。仪器：恒温水浴，布氏漏斗，抽滤瓶，真空泵，旋转蒸发仪，分液漏斗，紫外检测仪，硅胶 G 薄层板。四、实验步骤1.提取称取秦皮粗粉 100g，加 95%乙醇 300mL，水浴回流两次，每次 1 小时，过滤，合并滤液，减压回收至膏状，即得总提取物。2.分离上述浸膏加 40mL 蒸馏水，加热溶解，待水液冷却后转移至分液漏斗中，以等体积氯仿洗涤两次。将氯仿洗涤过的水液置水浴上加热除去残

38、留的氯仿。待水液冷却后以等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液。用无水硫酸钠脱水。减压回收溶剂至干，残留物溶于温热甲醇中，浓缩至适量，放置析晶，即有黄色针状结晶析出，滤取结晶，用甲醇重结晶，即得七叶内酯。将乙酸乙酯萃取过的水层浓缩至适量，放置，即有微黄色晶体析出。用甲醇、水反复结晶，即得七叶苷白色结晶。3.鉴定1）化学检识（1）观察荧光：将七叶苷和七叶内酯甲醇溶液分别滴在一滤纸上，于 254nm 观察荧光颜色。再喷氢氧化钠溶液，观察荧光变化；（2）三氯化铁试验：取七叶苷和七叶内酯少许，分别置试管中，加 1mL 乙醇溶解，加 1%三氯化铁溶液 23 滴，观察颜色。再加浓氨水 3 滴，观察颜色变化。

39、2）薄层鉴定吸附剂：硅胶 G 样品：七叶苷和七叶内酯展开剂：甲酸-甲酸乙酯-甲苯 （1：4：5）254nm 观察斑点荧光五、思考题制药分离工程实验 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定1.香豆精提取方法都有哪些？2.分析提取各步骤原理？制药分离工程实验 大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷实验八 大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷一、实验目的掌握大孔吸附树脂的性质和使用原理；学习用大孔吸附树脂分离天然亲水性成分的工艺过程以及工艺参数优化方法。二、实验原理白头翁（PulsatiLla chinenesis）为常用传统中药，其味苦、性寒，有清热解毒、凉血止痢等功效，现代药理学研究表明其具有抗阿米巴原虫、

40、抗菌、抗滴虫、抗肿瘤作用。白头翁中主要含有皂苷类成分。大孔吸附树脂是一种不含交换基团的具有大孔结构的高分子吸附剂，是一种亲脂性物质，具有各种不同的表面性质，依靠分子中的亲脂键、偶极离子及氢键的作用，可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物，同时也容易解吸附。大孔吸附树脂按极性强弱分为极性、中极性和非极性三种。大孔吸附树脂具有吸附速度快，选择性好，吸附容量大，再生处理简单，机械强度高等优点。根据反相色谱和分子筛原理，对大分子亲水性成分吸附力弱，对非极性物质吸附力强，适用于亲水性和中等极性物质的分离，可除去混合物中的糖和低极性小分子有机物，被分离组分间极性差别越大，分离效果越好。一般用水、含

41、水甲醇或乙醇、丙酮洗脱，最后用浓醇或丙酮洗脱，再生时用甲醇或乙醇浸泡洗涤即可。本实验采用 D101 型大孔吸附树脂提取分离白头翁中的皂苷。三、试剂与仪器试剂：D101 型大孔吸附树脂，乙醇，白头翁粗粉，正丁醇，醋酸，乙醚，蒸馏水，丙酮，活性炭，棉花、硫酸。仪器：烧杯，漏斗，滤纸，三角烧瓶，球形冷凝管，索氏提取器，电子天平，恒温水浴，硅胶薄层板，毛细管，色谱柱，色谱层析缸。四、实验步骤(1)大孔吸附树脂的预处理 取 D101 型大孔吸附树脂 100g 于 500mL 索氏提取器中，用150mL 乙醇回流 3h，待回流液 1 份加 3 份水无混浊时，取出树脂沥干乙醇，放入蒸馏水中，浸泡待用。(2)

42、皂苷的提取 取粉碎后得到的白头翁药材粗粉 50g，加入 200mL 工业酒精回流 2h，过滤，再重复提取一次，合并滤液，回收乙醇至 10mL，加 50mL 乙醚沉淀，倒出上清液，制药分离工程实验 大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷过滤，沉淀用水溶解，活性炭脱色、过滤、滤液上柱。(3)色谱分离 取一玻璃柱，下端塞上棉花，湿法装入已处理好的 60g 大孔吸附树脂，上端再加少许棉花，取总皂苷液上柱，用水 200mL 洗脱，再用 20%、50%、95% 乙醇各 200mL洗脱，至洗脱液中不含皂苷，收集各洗脱液。洗脱液 20%乙醇、50% 乙醇部分各取 10mL 于水浴加热蒸发浓缩至 2mL 点样；95%

43、部分于水浴回收至小体积(约 30mL)点样用。(4)产品的薄层色谱鉴定色谱材料：硅胶薄层板。点样：20%乙醇浓缩液、 50%乙醇浓缩液、95%乙醇浓缩液。展开剂：正丁醇-醋酸-水(4：1：1) 。展开方式：预饱和后，上行展开。显色：10%硫酸液 105 显色。五、实验结果与讨论记录实验条件、现象、图谱、斑点颜色、各试剂用量及产品的重量。六、注意事项配制展开剂时要充分摇匀。用乙醚沉淀时要一边搅拌一边倒入乙醚，使沉淀完全。乙醚沸点低，要注意安全。七、思考题1大孔吸附树脂法提取分离皂苷的原理是什么？有何特点？2为什么要进行树脂的预处理？制药分离工程实验 重结晶及过滤实验九 重结晶及过滤一、实验目的：

44、1、学习重结晶法提纯固体有机化合物的原理和方法；2、掌握重结晶的基本操作； 3、练习普通过滤、抽气过滤和热过滤的操作技术；4、练习和掌握固体试剂的取用；5、练习和掌握直接加热、固体的溶解和结晶等操作。 二、实验原理重结晶是纯化固体化合物的重要方法之一。其原理是利用被提纯物质与杂质在某溶剂中溶解度的不同分离纯化的。其主要步骤为：（1）将不纯固体样品溶于适当溶剂制成热的近饱和溶液；（2）如溶液含有有色杂质，可加活性炭煮沸脱色，将此溶液趁热过滤，以除去不溶性杂质；（3）将滤液冷却，使结晶析出；（4）抽气过滤，使晶体与母液分离。洗涤、干燥后测熔点，如纯度不合要求，可重复上述操作。必须注意，杂质含量过多

45、对重结晶极为不利，影响结晶速率，有时甚至妨碍结晶的生成。重结晶一般只适用于杂质含量约在百分之五以下的固体化合物，所以在结晶之前应根据不同情况，分别采用其他方法进行初步提纯，如水蒸气蒸馏，萃取等，然后再进行重结晶处理。 重结晶的关键是选择合适的溶剂，理想溶剂应具备以下条件：（1）不与被提纯物质起化学反应；（2）被提纯物质在温度高时溶解度大，而在室温或更低温度时，溶解度小；（3）杂质在热溶剂中不溶或难溶，在冷溶剂中易溶；（4）容易挥发，易与结晶分离；（5）能得到较好的晶体。除上述条件外，结晶好、回收率高、操作简单、毒性小、易燃程度低、价格便宜的溶剂更佳。常用溶剂，如水、乙醇、丙酮、苯等。三、试剂与

46、仪器试剂：粗苯甲酸，蒸馏水，活性炭。仪器：烧杯，电热套，保温漏斗，玻璃板，滤纸，电子天平。四、实验步骤1、称 1g 粗苯甲酸于 100mL 烧杯中，加入 40mL 蒸馏水，加热至沸使其溶解，稍冷，加少制药分离工程实验 重结晶及过滤量活性炭，继续加热煮沸 5min；2、趁热进行热过滤，冷却，析晶；3、完全析晶后，抽滤，洗涤 2-3 次，抽滤至干；4、晾干，称重并计算产率。六、存在的问题和注意事项存在问题：1、加热溶解固体时，溶液未注意补水，成了过饱和溶液；2、热过滤时有晶体析出在滤纸和漏斗颈上；3、活性炭因滤纸破被引入到滤液中；4、冷却析晶不充分，晶体量太少；5、活性炭吸附不充分，得到的晶体发黄

47、；。6、析晶时搅拌溶液，得到的晶体成渣状。注意事项：1、加热过程中应注意补充水分；2、应使活性炭脱色完全；3、注意热过滤的有关问题；4、静置析晶，使晶体析出完全。七、装置图菊花形滤纸的折叠法热过滤 抽气过滤八、思考题1、简述重结晶的主要步骤及各步的主要目的。2、活性炭为何要在固体物质完全溶解后加入？为什么不能在溶液沸腾时加入？3、对有机化合物进行重结晶时，最适宜的溶剂应具备哪些条件？4、辅助析晶的措施有哪些？5、使用活性炭应注意哪些问题？6、为什么热水漏斗和未过滤的溶液要继续加热？ 制药分离工程实验 简单蒸馏及分馏实验十 简单蒸馏及分馏一、实验目的1、熟悉蒸馏和测定沸点的原理，了解蒸馏和测定沸点的意义；2、掌握蒸馏和测定沸点的操作要领和方法；3、初步掌握蒸馏装置的装配和拆卸技能；4、掌握分馏柱的工作原理和常压下的简单分馏的实验操作方法。二、实验原理液体的分子由于分子运动有从表面逸出的倾向，这种倾向随着温度的升高而增大。如果把液体置于密闭的真空体系中，液体分子不断逸出而在液面上部