玉米青贮中产共轭亚油酸菌的筛选与鉴定.pdf

1、 第 27 卷 第 1 期2008 年 1 月 食 品 与 生 物 技 术 学 报Journal of Food Science and Biotechnology Vol. 27 No. 1Jan. 2008文 章 编 号 :167321689 (2008) 0120090205收 稿 日 期 :2006212228.基 金 项 目 :国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (30671526) .作 者 简 介 : 杜 波 (19802) ,男 ,安 徽 亳 州 人 ,农 学 硕 士 .主 要 从 事 饲 料 生 物 技 术 研 究 . Email :duboman 163. com3 通

2、 讯 作 者 : 程 茂 基 (19682) ,男 ,安 徽 六 安 人 ,教 授 ,农 学 博 士 ,硕 士 生 导 师 ,主 要 从 事 饲 料 生 物 技 术 研 究 . Email :cmj681212 sohu. com玉 米 青 贮 中 产 共 轭 亚 油 酸 菌 的 筛 选 与 鉴 定杜 波 1 , 陈 丽 娟 1 王 力 生 1 , 王 菊 花 1 , 蔡 玉 华 2 , 高 翔 1 ,方 华 平 1 , 刘 莉 君 1 , 马 广 智 1 , 程 茂 基 3 1(1. 安 徽 农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 ,安 徽 合 肥 230036 ; 2. 安 徽 农 业 大

3、 学 生 命 科 学 学 院 ,安 徽 合 肥230036)摘 要 : 从 玉 米 青 贮 中 分 离 到 一 株 共 轭 亚 油 酸 生 产 菌 (ANCL A01) ,发 酵 液 中 共 轭 亚 油 酸 生 成 量 为331442 g/ mL ;菌 株 为 革 兰 氏 染 色 阳 性 杆 菌 且 菌 体 短 直 、 两 端 钝 圆 ,不 产 芽 孢 ;发 酵 时 有 乳 酸 生 成 ,属 于 同 型 发 酵 B 型 并 对 底 物 要 求 特 殊 的 乳 酸 杆 菌 ;分 子 生 物 学 鉴 定 结 果 表 明 ,该 菌 株 与 L actoba2cill us pl ant arum s

4、train L5 的 16S rRNA 碱 基 序 列 相 似 性 达 99193 %。 兼 顾 该 菌 株 传 统 鉴 定 方 法 ,确 定 其 为 植 物 乳 杆 菌 ( L actobacill us pl ant arum) 。 结 果 表 明 :ANCL A01 菌 株 是 青 贮 玉 米 中 确 产 共轭 亚 油 酸 的 植 物 乳 杆 菌 。关 键 词 : 共 轭 亚 油 酸 ;青 贮 ;植 物 乳 杆 菌 ;鉴 定中 图 分 类 号 : TQ 920. 6 文 献 标 识 码 : AScreening and Identif ication of Lactic Acid Bac

5、teria forBiosynthesis of Conjugated Linoleic Acid from Maize SilageDU Bo1 , CH EN Li2juan1 , WAN G Li2sheng1 , WAN G J u2hua1 , CHA I Yu2hua2 ,GAO Xiang1 , FAN G Hua2ping1 , L IU Li2jun1 , MA Guang2Zhi1 , CH EN G Mao2ji 3 1(1. College of Animal Science and Technology , Anhui Agricultural University

6、, Hefei 230036 ,China ; 2. Life ScienceCollege , Anhui Agricultural University , Hefei 230036 ,China)Abstract :A bacteria , ANCL A01 , which could convert linoleic acid to conjugated linoleic acid ,was screened from maize Silage. The CL A yield of t he fermentation brot h was 33. 442 g/ mL ;The germ

7、 was a Gram - positive rod while showed as short and straight , t he beginnings and endsobt use circle , no production of spore. Lactic acid was produced when it was been fermented. Itsa kind of B acill us aci di lactici which belonged to type B of homofermentation as well had t hespecial requiremen

8、t of substrate in medium. Moreover , 16S ribosomal RNA gene had 99. 93 %sequence similarity wit h Lactobacillus plantarum strain L5. The result s showed that t he bacteriahaving t he ability of bioconversion of linoleic acid into conjugated linoleic acid in silage.Key words : conjugated linoleic aci

9、d ; silage ; L actobacill us pl ant arum ; identification 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/共 轭 亚 油 酸 ( Conjugated Linoleic Acid ,CL A)是 由 亚 油 酸 衍 生 的 共 轭 双 烯 酸 的 多 种 位 置 与 几 何异 构 体 的 总 称 ,具 有 增 强 人 体 免 疫 、 抗 癌 、 抗 动 脉 粥样 硬 化 、 降 低 胆 固 醇 、 改 善 骨

10、 组 织 代 谢 等 多 种 功能 1 。 天 然 CL A 是 由 亚 油 酸 经 微 生 物 氢 化 而 成 。人 们 先 后 在 反 刍 动 物 瘤 胃 、 牛 乳 、 婴 儿 粪 便 和 酸 泡菜 中 发 现 溶 纤 维 丁 酸 弧 菌 、 埃 氏 巨 球 菌 2 - 3 、 费 氏丙 酸 杆 菌 4 和 乳 酸 菌 5 能 够 分 泌 亚 油 酸 异 构 酶 ,可将 亚 油 酸 转 化 成 为 CL A。 但 家 畜 青 贮 饲 料 中 是 否存 在 产 CL A 的 细 菌 尚 不 清 楚 。 程 茂 基 等 6 首 次 在青 贮 饲 料 中 检 测 到 CLA ,其 含 量 为

11、2 4 mg/ g ,表明 青 贮 中 确 实 存 在 一 种 能 将 亚 油 酸 转 化 成 为 CL A的 微 生 物 ,但 其 是 否 为 乳 酸 菌 也 不 清 楚 。 为 此 ,作者 对 青 贮 中 产 CLA 的 细 菌 展 开 筛 选 ,并 进 行 鉴 定 ,旨 在 为 利 用 发 酵 调 控 技 术 来 提 高 青 贮 中 CL A 含 量提 供 理 论 依 据 。1 材 料 与 方 法111 材 料玉 米 青 贮 采 集 于 合 肥 市 白 帝 乳 业 发 展 公 司 ;培养 基 : p H 615 618 , MRS 肉 汤 培 养 基 , P Y 培 养基 ,MRS 固

12、体 培 养 基 ,MRS 半 固 体 培 养 基 ,MRS 液体 培 养 基 和 补 添 011 g/ dL L A 的 MRS 液 体 培 养基 。 培 养 基 使 用 前 均 于 121 高 压 蒸 汽 下 灭 菌 20min。112 主 要 试 剂LA 和 CL A :纯 度 99 % ,购 自 Sigma 公 司 ;细菌 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 、 PCR 试 剂 盒 和 胶 回 收试 剂 盒 ,购 自 宝 生 物 工 程 (大 连 ) 有 限 公 司 ;其 它 试剂 均 为 分 析 纯 。113 菌 种 筛 选11311 初 筛 采 集 青 贮 后 立 即 选 取 感

13、 官 指 标 较 好的 青 贮 枝 叶 浸 入 37 双 蒸 水 中 ,浸 泡 10 min 后 去除 枝 叶 ,吸 取 新 鲜 均 匀 浸 泡 液 10 mL 加 到 500 mL装 有 300 mL MRS 肉 汤 培 养 基 的 三 角 烧 瓶 中 。 37 静 止 增 菌 96 h 后 ,稀 释 涂 布 平 板 法 倾 倒 MRS 琼脂 平 板 ,四 区 划 线 后 于 37 厌 氧 培 养 48 h ,挑 取 单菌 落 穿 刺 接 种 于 MRS 半 固 体 培 养 基 中 ,37 培 养后 放 于 冰 箱 保 存 。11312 复 筛 将 初 筛 保 存 菌 种 于 37 活 化

14、后 ,按体 积 分 数 5 %的 接 种 量 接 种 于 装 有 10 mL MRS 液体 培 养 基 的 带 螺 帽 试 管 (18 mm 160 mm) 中 ,其 中MRS 液 体 培 养 基 中 亚 油 酸 含 量 为 011 g/ dL 。 N2驱 除 空 气 ,厌 氧 发 酵 24 h 后 测 定 CL A ,以 筛 选 出 产CL A 细 菌 。114 CLA测 定以 正 己 烷 为 溶 剂 ,将 CL A 标 样 配 成 不 同 浓 度的 溶 液 ,以 正 己 烷 为 参 比 ,在 233 nm 处 测 定 其 吸 收值 ,以 CL A 质 量 浓 度 ( g/ mL) 为 横

15、坐 标 ,吸 光 值 为纵 坐 标 ,绘 制 标 准 曲 线 。 发 酵 液 中 CLA 的 提 取 按Jiang 等 (1998)方 法 操 作 。 将 所 获 得 脂 肪 酸 提 取 物用 5 mL 正 己 烷 溶 解 ,以 不 接 种 的 发 酵 液 提 取 物 为参 比 ,用 紫 外 分 光 光 度 计 在 200 350 nm 范 围 内 扫描 ,读 取 特 征 吸 收 峰 233 nm 处 的 吸 收 值 ,根 据 标 准曲 线 计 算 发 酵 液 中 CL A 的 含 量 7 。 对 照 样 为 培 养基 加 入 与 样 品 同 量 的 亚 油 酸 ,不 接 菌 种 ,其 它 步

16、 骤同 样 品 。115 菌 种 鉴 定11511 菌 落 及 形 态 观 察 将 获 得 的 高 产 菌 株 活 化后 ,通 过 四 区 划 线 法 接 种 于 MRS 平 板 培 养 基 上 ,厌氧 培 养 24 h 后 观 察 菌 落 特 征 。 革 兰 氏 染 色 后 于 光学 显 微 镜 下 观 察 菌 株 形 态 特 征 ,测 定 菌 体 的 长 度 和宽 度 等 。11512 生 理 生 化 鉴 定 参 照 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 (1994) ,对 获 得 的 共 轭 亚 油 酸 高 产 菌 株 进 行 接 触 酶反 应 、 明 胶 液 化 试 验 、 产 硫 化 氢

17、反 应 、 吲 哚 反 应 、 温度 生 长 范 围 等 实 验 进 行 初 步 鉴 定 。 从 葡 萄 糖 产 酸 、产 气 实 验 及 甘 露 糖 、 棉 子 糖 等 生 理 和 生 化 方 面 进 行分 类 鉴 定 ,实 验 参 照 乳 酸 细 菌 分 类 鉴 定 及 实 验 方法 ,具 体 操 作 见 文 献 8 - 10 。11513 分 子 生 物 学 鉴 定 模 板 的 制 备 、 菌 株 16SrDNA 的 PCR 扩 增 及 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 目 的 片 段的 回 收 与 纯 化 均 按 试 剂 盒 说 明 步 骤 操 作 。 然 后 将回 收 到 的 目 的

18、片 段 送 由 宝 生 物 工 程 (大 连 ) 有 限 公司 测 序 。 将 测 序 结 果 运 用 BL AST 软 件 与 Gene2bank 中 已 登 陆 细 菌 的 16S rRNA 序 列 比 较 ,找 到 与其 相 似 性 最 高 的 登 录 菌 株 序 列 号 并 调 出 其 登 录 序列 ,进 行 差 异 比 较 。2 结 果 与 分 析211 菌 种 的 筛 选在 厌 氧 条 件 下 发 酵 培 养 时 ,共 分 离 出 17 株 生成 CL A 能 力 较 强 的 菌 株 。 由 表 1 可 知 ,分 离 出 的菌 株 CLA 生 成 量 在 41316 331442

19、g/ mL ,其 中12 号 菌 株 CL A 产 量 最 高 为 331442 g/ mL 。 该 菌株 被 命 名 为 ANCL A01。212 菌 株 鉴 定21211 菌 种 的 菌 落 及 形 态 观 察 ANCL A01 号 菌株 MRS 固 体 培 养 后 观 察 发 现 ,菌 落 凸 起 、 圆 形 、 表面 光 滑 并 呈 白 色 ,见 图 1。 革 兰 氏 染 色 后 油 镜 下 观19 第 1 期 杜 波 等 :玉 米 青 贮 中 产 共 轭 亚 油 酸 菌 的 筛 选 与 鉴 定 1994-2008 China Academic Journal Electronic P

20、ublishing House. All rights reserved. http:/察 发 现 ,ANCL A01 号 菌 株 革 兰 氏 染 色 呈 阳 性 ,菌 体短 直 、 两 端 钝 圆 ,无 芽 孢 ,菌 体 宽 为 019 111 m 范围 ,长 为 2 7 m ,呈 单 体 、 队 列 或 短 链 状 。 AN2CL A01 号 菌 落 形 态 与 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 中 所 描述 的 植 物 乳 杆 菌 形 态 特 征 较 为 一 致 。 8 表 1 不 同 菌 株 生 物 转 化 共 轭 亚 油 酸 的 能 力Tab. 1 The ability of CLA

21、 biosynthesis by the various strains编 号 CLA 产 量 /( g/ mL) 编 号 CLA 产 量 /( g/ mL)1 13. 342 10 7. 3152 11. 269 11 12. 0053 23. 013 12 33. 4424 25. 867 13 24. 0235 15. 009 14 9. 166 17. 301 15 4. 3167 9. 213 16 9. 3238 10. 532 17 21. 5379 11. 663图 1 ANCLA01 号 乳 杆 菌 ( 22 100)Fig. 1 The morphology of ANCL

22、A01 strain21212 生 理 生 化 检 验 糖 发 酵 试 验 表 明 , AN2CL A01 号 菌 株 发 酵 葡 萄 糖 后 无 气 体 产 生 ;生 长 温 度测 定 后 发 现 ,菌 株 于 15 能 发 育 增 殖 ,45 基 本 不生 长 ;乳 酸 生 成 检 测 试 验 发 现 ,发 酵 液 中 有 乳 酸 生成 。 兼 顾 上 述 菌 株 形 态 特 征 ,提 示 该 菌 属 同 型 发 酵B 型 乳 酸 杆 菌 。ANCLA01 号 菌 株 的 过 氧 化 氢 酶 检 验 、 明 胶 液化 试 验 、 硫 化 氢 反 应 和 吲 哚 反 应 ,结 果 均 呈 阴

23、 性 。由 表 2 可 以 看 出 ,ANCL A01 号 菌 株 对 甘 露 糖 、 棉 子糖 、 甘 露 醇 、 核 糖 、 纤 维 二 糖 、 山 梨 醇 、 果 糖 、 蔗 糖 、 半乳 糖 、 海 藻 糖 、 乳 糖 、 木 糖 、 麦 芽 糖 、 松 三 糖 等 发 酵 结果 均 呈 阳 性 ,而 鼠 李 糖 发 酵 结 果 呈 阴 性 。 图 2 表明 ,ANCL A01 号 菌 具 有 较 强 的 耐 酸 性 。 以 上 结 论均 与 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 中 所 描 述 的 植 物 乳 杆 菌的 生 理 生 化 特 性 完 全 一 致 。表 2 菌 株 ANCLA0

24、1 对 发 酵 底 物 中 碳 水 化 合 物 的 利 用Tab. 2 Utilization of carbohydrate substrates to ANCLA01底 物 反 应 结 果 底 物 反 应 结 果甘 露 糖 + 棉 子 糖 +甘 露 醇 + 鼠 李 糖 -葡 萄 糖 + 核 糖 +纤 维 二 糖 + 山 梨 醇 +果 糖 + 蔗 糖 +半 乳 糖 + 海 藻 糖 +乳 糖 + 木 糖 +麦 芽 糖 + 松 三 糖 +图 2 菌 株 ANCLA01 发 酵 液 中 pH值 随 时 间 变 化 曲 线Fig. 2 Time2course of pH value21213 分 子

25、 生 物 学 鉴 定 由 图 3 可 见 , PCR 扩 增所 得 的 ANCLA01 菌 株 的 16S rDNA 目 的 片 断 ,其扩 增 产 物 大 小 在 1 500 bp 左 右 ,测 序 后 该 菌 株 的 目的 片 断 为 1 487 bp ( EF185922) 。 将 该 菌 株 的 16SrRNA 序 列 应 用 BL AST 程 序 与 GenBank 中 的 细菌 数 据 库 进 行 同 源 性 比 较 ,结 果 显 示 该 菌 株 的 16SrRNA 全 长 序 列 和 植 物 乳 杆 菌 (L actobacill us pl an2t arum strain L

26、5)的 16S rRNA 全 长 1 532 bp 序 列(DQ23969811)相 比 ,同 源 性 达 99193 % ;差 异 比 较发 现 ,ANCL A01 菌 株 16S rRNA 序 列 的 第 5 个 碱基 以 后 的 1 482 个 碱 基 序 列 与 L actobacill us pl an2t arum strain L5 的 第 26 个 碱 基 后 的 1 482 个 碱 基序 列 完 全 相 同 。 由 此 ,在 细 菌 系 统 发 育 分 类 学 上 进一 步 证 实 ANCL A01 菌 株 确 系 植 物 乳 杆 菌 。综 合 对 该 菌 的 菌 落 及 形

27、 态 观 察 、 生 理 生 化 鉴 定和 分 子 生 物 学 鉴 定 结 果 ,可 以 确 定 ANCL A01 号 菌株 为 乳 杆 菌 属 植 物 乳 杆 菌 ( L actobacill us pl anta2rum) 。29 食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 27 卷 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/图 3 ANCLA01 号 菌 株 PCR扩 增 条 带Fig. 3 The electrophoretogram of 16S rRN

28、A after PCRamplif ication3 结 语微 生 物 菌 种 鉴 定 方 法 有 多 种 ,其 中 常 规 生 理 生化 分 析 和 16S rRNA 基 因 序 列 分 析 通 常 被 用 于 杆菌 鉴 定 。 Vaneechoutte 等 用 Cfo I、 Mbo I、 RsaI 等 3种 限 制 性 内 切 酶 消 化 16S rRNA 扩 增 产 物 ,成 功 地对 99 株 18 种 不 同 菌 种 的 分 枝 杆 菌 进 行 鉴 定 10 。Avaniss2Aghajan 等 也 用 16S rRNA 基 因 序 列 分 析法 和 引 物 荧 光 标 记 法 相

29、结 合 准 确 地 鉴 定 了 13 种 分枝 杆 菌 11 。 作 者 分 离 出 的 乳 酸 菌 先 采 用 常 规 生 理生 化 分 析 法 确 定 其 为 植 物 乳 杆 菌 ,后 又 采 用 16SrRNA 基 因 序 列 分 析 法 进 一 步 确 定 其 为 植 物 乳 杆菌 。 结 果 也 提 示 :常 规 生 理 生 化 分 析 和 16S rRNA基 因 序 列 分 析 同 样 准 确 、 有 效 。共 轭 亚 油 酸 生 产 主 要 以 细 菌 为 主 ,瘤 胃 细 菌 是研 究 最 多 的 CL A 生 产 菌 。 Kepler 等 首 先 发 现 c9 ,t112CL

30、 A 是 瘤 胃 中 溶 纤 维 丁 酸 弧 菌 ( B ut y rivibriof ibrisol vens ) 能 够 对 亚 油 酸 进 行 生 物 氢化 , 将 亚 油 酸 转 化 成 为 共 轭 亚 油 酸 。 Jiang 等研 究 发 现 以 牛 乳 为 培 养 基 ,费 氏 丙 酸 杆 菌 ( Propi2onibacteri um f reu denreichii) 可 以 将 亚 油 酸 氢 化 生成 CL A ,并 且 在 对 数 生 长 期 CL A 产 量 最 高 ,亚 油 酸转 化 率 超 过 80 %。近 年 来 ,乳 酸 菌 发 酵 培 养 生 产 CL A 备

31、 受 关 注 。Lin 等 发 现 嗜 酸 乳 杆 菌 在 6 种 乳 酸 菌 中 CL A 产 量最 高 。 随 后 ,陆 续 在 酸 奶 、 酸 泡 菜 和 婴 儿 粪 便 中 发现 植 物 乳 杆 菌 13 、 路 氏 乳 杆 菌 14 也 可 以 将 亚 油 酸转 化 成 为 CL A。青 贮 是 乳 酸 菌 迅 速 增 殖 产 生 乳 酸 ,使 腐 败 菌 生长 受 到 抑 制 ,进 而 长 期 保 存 青 绿 饲 料 的 一 种 技 术 。程 茂 基 等 首 次 发 现 玉 米 青 贮 中 含 有 微 量 CL A。 本试 验 进 一 步 证 实 ,植 物 乳 杆 菌 是 青 贮

32、中 产 CLA 的微 生 物 之 。 青 贮 过 程 有 多 种 微 生 物 参 与 发 酵 ,主 要有 乳 酸 菌 ( L actic aci d bacteri a ) 、 梭 状 芽 孢 杆 菌( Clost ri di a) 、 大 肠 杆 菌 ( Escherichi a coli ) 、 枯 草 杆菌 ( B acill us subtilis) 、 蜡 状 芽 孢 杆 菌 ( B acill us cere2us) 、 迟 缓 芽 孢 杆 菌 ( B acill us lent us) 、 球 形 芽 孢 杆 菌( B acill us s p haericus ) 、 酵 母

33、菌 ( Yeast ) 和 霉 菌(Mold)等 。 除 植 物 乳 酸 杆 菌 之 外 的 其 它 杆 菌 、 酵 母和 霉 菌 是 否 产 CL A 尚 不 清 楚 。日 粮 中 添 加 CLA 后 ,家 畜 饲 料 报 酬 改 善 ,脂 肪硬 度 增 加 ,脂 肪 含 量 降 低 ,瘦 肉 率 提 高 15 。 日 粮 添加 脂 肪 或 改 变 脂 肪 组 成 ,奶 畜 乳 中 CLA 含 量 明 显提 高 17 - 18 。 因 此 ,增 加 日 粮 CL A 含 量 和 调 控 日 粮脂 肪 比 例 与 结 构 迅 速 成 为 动 物 营 养 与 饲 料 研 究 的热 点 。 如 将

34、 本 试 验 筛 选 分 离 出 的 ANCL A01 号 乳酸 菌 选 育 批 量 扩 培 后 ,重 新 回 接 到 青 贮 中 可 望 生 产出 CL A 功 能 性 青 贮 。参 考 文 献 ( References) : 1 Arunabh Bhattacharya , Jameela Banu , Mizanur Rahman , et al. Biological effects of conjugated linoleic acids in health anddiseaseJ . The Journal of Nutritional Biochemistry ,2006 ,17

35、 :789 - 810. 2 Kepler C R , Hirons K P , Mcneill J J , et al. Tove intermediates and products of the biohydrogenation of linoleic acid byB ut y rivibrio f ibrisolvens J . The Journal of Biological Chemistry , 1966 ,241 (6) :1350 - 1354. 3 Kim Y J , Liu R H , Bond D R , et al. Effect of linoleic acid

36、 concentration on conjugated linoleic acid production by B u2t y rivibrio f ibrisol vens A38J . Appl Environ Microbiol ,2000 ,66 :5226 - 5230. 4 Jiang J , Bjorck L , Fonden R. Production of CL A by dairy starter culture J . Journal of Applied Microbiology , 1998 ,85(5) :95 - 102. 5 Lin H , Boylston

37、T D. Conjugated linoleic acid content of cheddar2type cheeses as affected by processing J . Journal ofFood Science , 1999 ,64 (5) :874 - 878. 6 程 茂 基 ,杜 波 . 玉 米 青 贮 饲 料 中 共 轭 亚 油 酸 的 含 量 研 究 J . 畜 牧 与 饲 料 科 学 ,2006 ,2 :23 - 24.39 第 1 期 杜 波 等 :玉 米 青 贮 中 产 共 轭 亚 油 酸 菌 的 筛 选 与 鉴 定 1994-2008 China Acade

38、mic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/CH EN G Mao2ji , Du Bo. Studies on the content of conjugated linoleic acid in maize silageJ . Animal Husbandry and FeedScience , 2006 ,2 :23 - 24. (in Chinese) 7 Pariza M W , Yang X Y. Method of producing conjugated fatty acids P .

39、USPatent :5856149 ,1999207202. 8 E Buchanan ,N E Gibbons. 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 (第 九 版 ) M . 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 “ 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 ” 翻 译 组 译 .北京 :科 学 出 版 社 ,1994. 9 诸 葛 健 ,王 正 祥 . 工 业 微 生 物 实 验 技 术 手 册 M .北 京 :中 国 轻 工 出 版 社 ,1994 ,170 - 188.10 Vaneechoutte M , Claeys G , Claeys G. Identification of M yc

40、obacteri um species by using amplified ribosomal DNA restric2tion analysisJ . J Clin Microbiol ,1993 ,31 (8) :2061 - 2065.11 Avaniss2Aghajan E , Holtzman A , Holtzman A. Molecular technique for rapid identification of mycobacteria J . J ClinMicrobiol ,1996 ,34 :98 - 102.12 Lin T Y ,Lin C W ,Wang YJ

41、. Linoleic acid isomerase activity in enzyme extracts from L actobacill us aci dop hil us and Pro2pinibacteri um f reudenreichii ssp. shermaniiJ . Food Chemistry and Safety ,2002 ,67 (4) :1502 - 1505.13 Ham J S , Jeony S G , Jeony S G. Screening of conjugated linoleic acid producing lactic acid bact

42、eria from fecal samples ofhealthy babiesJ . Asian2Aust J Anim Sci ,2002 ,15 (7) :1031 - 1035.14 Lee S O , Kim C S , Cho S K , et al. Bioconversion of linoleic acid into conjugated linoleic acid during fermentation and bywashed cells of L actobacill us reuteri J . Biotechnology Letters ,2003 ,25 (12)

43、 :935 - 938.15 Averette Gatlin L , See M T , Larick D K , et al. Descriptive flavor analysis of bacon and pork loin from lean2genotype giltsfed conjugated linoleic acid and supplemental fat J . J Anim Sci ,2006 ,84 (12) : 3381 - 3386.16 Reynolds C K , Cannon V L , Loerch S C. Effects of forage sourc

44、e and supplementation to soybean and marine algal oil onmilk fatty acid composition of ewesJ . Animal Feed Science and Technology , 2006 , 131 :333 - 357.17 Bargo F , Delahoy J E , Schroeder G F , et al. Muller Supplementing total mixed rations with pasture increase the contentof conjugated linoleic

45、 acid in milkJ . Animal Feed Science and Technology , 2006 , 131 :226 - 240. 18 Gillis M H , Duckett S K , Sackmann J R , et al. Effects of supplemental rumen2protected conjugated linoleic acid or linole2ic acid on feedlot performance , carcass quality , and leptin concentrations in beef cattle J . J Anim Sci , 2004 ,82 :851 -859.(责 任 编 辑 :李 春 丽 )49 食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 27 卷 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/