1、高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography分析化学教研室HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6小结习题及解答一、概述高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法HPLCHRLCSPLCUPLC与经典LC相比三大区别：高效高效填料：5m 高压泵输液高灵敏度的检测器:在线检测一、概述分析对象流动相差别GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%惰性气体HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的80%液体，种类较多，选择余地广HPLC与GC区别一、
2、概述HPLC仪器示意图一、概述Agilent 1100一、概述HPLC仪器图SHIMAZUAGILENTWATERS一、概述applicationHPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6二、基本原理范氏方程 ：GC填充柱H = A + B/u + Cu毛细管柱H = B/u + CuHPLCH = A + CuTu忽略B/umDB = 2QTDm二、基本原理GC和HPLC的H-u图1 B/u 2 Cu 3 A 4 HPLC的uopt5 GC的uopt二、基本原理 HPLCH = A + CuA=2dC=Cm +Csm影响因素： 选粒径小的球形固定相 d选化学
3、键合相，匀浆法装柱 C选粘度小、低流速的流动相，室温msmmDdpCC2=mDdpC2TDmHPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（LSC）1液液分配色谱法（LLC）2化学键合相色谱法（BPC）3三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法 分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心 固定相:硅胶 流动相:底剂（烷烃）+ 极性调节剂 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱三、各类高效液相色谱法液液分配色谱法 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 分类:正相色谱NPLC固定液极性 流动相极性极性小的组分先出柱，
4、极性大的组分后出柱反相色谱RPLC固定液极性 流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法(bonded phase chromatography,BPC)化学键合相色谱法(bonded phase chromatography,BPC)固定液的官能团通过化学反应键合在载体表面反相键合相离子抑制正相键合相离子对三、各类高效液相色谱法1. 反相键合相色谱法(RBPC) 分离机制：疏溶剂理论等 固定相：非极性的键合相如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱) 流动相：极性大的流动相如:甲醇-水或乙腈-水 流动相极性与k的关系:极性，洗脱能力，k，组分tR极
5、性大的组分先出柱 应用：非极性-中等极性组分(80%)三、各类高效液相色谱法2. 正相键合相色谱法(NBPC) 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂 流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k结构相近组分，极性大的组分后出柱三、各类高效液相色谱法3. 离子对色谱法(IPC,PIC) 分离机制：在流动相中加入离子对试剂，使形成不带电的中性离子对，以改善分离 机理：流动相固定相B+H+ BH+RSO3 Na RSO-3 +Na+BH+.RSO-3 BH+.RSO-3 中性离子对增加了在非极性
6、固定相中溶解度。三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：分析对象 离子对试剂 例如碱 烷基磺酸钠C5、C6、C7、C8磺酸钠,SDS酸 四丁基季胺盐四丁基胺磷酸盐（TBA）三、各类高效液相色谱法4. 离子抑制色谱法(ISC) 分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的 适用范围：3.0pKa7.0 的弱酸7.0pKa8.0 的弱碱 抑制剂:弱酸（HAc）、弱碱（NH3H2O）或缓冲液HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6四、固定相液-固色谱固定相 硅胶无定形全多孔硅胶YWG球形全多孔硅胶YQG 高分
7、子多孔微球 YSG特点：柱选择性好，峰形好，柱效低四、固定相化学键合相特点： 不易流失;热稳定性好;化学性能稳定 载样量大;适于梯度洗脱分类:非极性键合相：ODS中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氯基键合相四、固定相非极性键合相：ODS 载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球 表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。 键合基团键长：键长，载样量，kHPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6五、流动相要求： 与固定液不反应;对样品有良好溶解度 粘度小;与检测器匹配22114 kknR+= 与固定相性质和流动相种类有关 k 与流动相配比有关五、流动相正相洗脱 流动相的极性小于固定相的洗脱反相洗脱 流动相的极性大于固定相的洗脱洗脱方式:等度洗脱(isocratic elution)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradient elution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例五、流动相
