1、饲料中三聚氰胺的检测方法三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，是一种重要的氮杂环有机化工原料，在饲料工业中作为粘合剂使用。目前国际上通常采用凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白质的含量。即求出氮的含量，再乘以一定的换算系数(通常用 625 系数计算)得出蛋白质含量。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，每个三聚氰胺分子中都含有 6 个氮原子，而在原料的粗蛋白检测过程中，用浓硫酸消化过程可以将三聚氰胺分解掉但在最后的计算中，三聚氰胺中的氮原子即可提高粗蛋白的比率，造成蛋白含量虚假增高。因此只要在饲料中添加一些含氮量高的化学物质，就可在检测中造成蛋白质含量达标的假象。饲料中非法添加化工原料可以提高
2、蛋白质检测数值，而用全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质含量时根本不能区分这种伪蛋白氮。在饲料中少量添加三聚氰胺即可大大提高蛋白含量。 l 三聚氰胺的性质11 物理性质分子式 C3N6H6 或 C3N3(NH2)3，分子量 12612,为纯白色单斜棱晶体，无味，低毒，密度 1573 gcm3（16）。常压熔点 354(分解)；快速加热升华，升华温度 300。溶于热水，微溶于冷水，极易溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物。12 化学性质三聚氰胺的水溶液呈弱碱性(pKb=8)，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草
3、酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性环境中(pH 值 55-65)与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物，其中三聚氰胺与甲醛水溶液的反应是最重要的反应。2 饲料中三聚氰胺的检测方法21 试剂盒检测法 fELISAl利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。211 样品处理称取 10 g 均质过的饲料样品于离心管中，加入 10 ml 甲醇充分混合,15 000 rmin 离心 10
4、min,取上清液 1 ml 于小试管中用氮气吹干，加入 25 ml 10甲醇和 20 mmoll PBS 溶液充分溶解，移取 100ul 进行分析。212 ELISA 检测步骤将所有试剂及样品提取液回升温度至室温(2028)，用前按试剂盒的要求稀释所用试剂取相应数量的微孔条，插入框架，吸取 100ul 标样或样品提取液到相应的微孔，每孔加入 50ul 三聚氰胺 HRP酶标记物，轻轻混合 60 s，孵育 30 minf20-28）。然后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用 250ul 洗液洗板 5 次；在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干；每孔加入 100ul 底物溶液，孵育 30 min(20-28)，每
5、孑 L 加入 100ul 终止液，用酶标仪读取在 450 nm 下的吸光值。213 作图 以所获得的标准和样品吸光值的平均值除以 0 标准的吸光值再乘以 100 为纵坐标，以三聚氰胺浓度半对数为横坐标作标准曲线，确定被测样品的浓度。22 液相检测法和气相色谱一质谱检测法试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，将提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定；净化后的洗脱液用氮气吹干，用 N，0一双三甲基硅基三氟乙酰胺 fBSTFA)衍生化，以气相色谱一质谱联用仪进行定性和定量测定。221 样品处理称取 500 g 试样，准确加入 50 ml 三氯
6、乙酸溶液(10g/l)，加入 2 m1 乙酸铅溶液(22g/l)，摇匀，超声提取 20 min，静置 2 min，取上层提取液约 30 ml 转入离心管，在 12 000 rmin 离心 5 min。分别用 3 ml 甲醇、3 ml 水活化混合型阳离子交换固相萃取柱。准确移取 10 ml 离心液分次上柱，控制过柱速度在 1 mlmin 以内再用 3 ml 水和 3 ml 甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽干后用 5氨化甲醇 3 ml 洗脱，洗脱液在 50下氮气吹干，准确加入 2 ml 甲醇溶液，涡漩振荡 1 rain，过045 Izm 膜，用高效液相色谱仪测定三聚氰胺含量。222 衍生根据
7、液相的定量结果将洗脱液稀释成浓度约为 05 Ixgml。分别吸取稀释液 05 ml 用氮气吹干，加入 250ul 吡啶和 250ul 衍生试剂，加盖，混匀，70 cc 反应 30 min，同时吸取 05ugml 的标准溶液 05 ml 做同步衍生，用气相色谱一质谱联用仪确证。223 仪器条件液相色谱条件紫外检测器，波长 240 nm；色谱柱 ZORBAX E clipse XDB-C8,柱长 150 mm，内径 46 mm，粒度 5 Ixm；流动相 A：B=93：7(A：称取庚烷磺酸钠 202 g 和柠檬酸 210 g 溶解，定容至 1 L；B：乙腈)，流动相流速 10 mlmin，进样量 1
8、0ul。气相色谱一质谱联用仪条件色谱柱 VF-5ms 30 m 025 mm 025um capillaiy column；进样口温度：250；进样量：1ul；柱温：起始温度 75，保持 1 min，以 30min 升温至 300，保持 2 min；载气、氦气流速：1-3 mlmin；传输线温度：280；溶剂延迟 55 min；EM 电压：高于调谐电压 200 V，离子阱温度：220；选择离子监测：fMZ)99、171、327、342。224 标准溶液的制备精密称取三聚氰胺标准品 0100 0 g，置于 100 ml 容量瓶中，用甲醇溶液溶解、稀释至刻度，得到浓度为 1 000 Ixgml 的
9、标准储备液；吸取标准储备液 1000 ml 于 100 ml 容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，得到浓度为 100ugm1 的标准中间液；分别吸取标准中间液 5、10、25、50 ml 于 100 ml容量瓶中，用甲醇溶液定容，得到浓度分别为 5、10、25、50、100ugml 的标准工作液。225 结果计算计算公式：X=CVnm。式中：X试样中三聚氰胺的含量(mgkg)；C标准曲线上查得的试样中三聚氰胺的浓度(ugm1)；V净化后加入的甲醇溶液体积(m1)；m试样质量(g1；n稀释倍数。3 工业上三聚氰胺的检测方法31 苦味酸法将水加入试样，加热溶解后，加入苦味酸溶液，称量所生成的苦味酸三聚
10、氰胺沉淀的质量，即测得三聚氰胺纯度含量。称取试样，置于 500 ml 锥形瓶中，同时加入水，加热溶解：冷却后，加入酚酞指示液 3 滴，若显色，加入硫酸溶液，直至溶液颜色消失，若有不溶物，需过滤，水洗；把滤液和洗液合并，移入 500 ml 容量瓶中，加水至刻度，仔细振摇混合后，准确吸取 100 ml 置于 500 ml 烧杯里：将此溶液加热至80，另加入已加热至 80 cC 的 100 ml 苦味酸溶液，冷却至室温后，保持在 15以下约 8 h：用已恒重的玻砂过滤器过滤，然后，先用约 100 m1 苦味酸三聚氰胺的饱和溶液洗涤，再用水洗：烘干玻砂过滤器，置于干燥器中冷却后，称量求得沉淀物质量。3
11、2 升华法在升华装置中将试样在负压下进行加热，让三聚氰胺完全升华后，称其残渣量，即测得三聚氰胺纯度。将样品置于预先干燥了的且已知质量的试样容器里；将试样容器置入减压升华装置内，待完全密闭后，开启真空装置缓缓吸引，并调节装置内的温度，经 2 h 升华结束：取出试样容器，冷至室温后，称量试样容器的质量。33 电位滴定法上述两种测定方法准确度均较高，但操作繁琐，分析时间太长，有人推荐采用电位滴定法。首先测定三聚氰胺溶液中总固体的含量，称取样品于 200 ml 烧杯中，加入 100 ml 蒸馏水，放于石棉网的电炉上加热在沸腾的情况下搅拌溶液，使试样完全溶解。在电磁搅拌状态下，用硫酸标准溶液滴定热溶液至
12、 pH 值为 5 左右。流水冷却溶液至室温，滴定，每次准确加入 01 ml 硫酸标液，并记下相应的 pH 值，直至 pH 值约为 3。计算出等当量点时消耗硫酸标液的体积。计算公式：Me=Sx6307x VxFM。式中：Me溶液中三聚氰胺的含量()；S溶液中总固体的含量()；V等当量点时消耗硫酸标液的体积(m1)；F 05 mol1 硫酸标液的校正系数：M滴定时所标取总固体的质量 fmg)；6307换算系数。饲料中三聚氰胺检测【样品前处理】 称取饲料样品 0.40g(精确到 0.01g)，置于 10mL 具塞刻度试管中，加入 7mL 1%三氯乙酸，涡旋混匀，超声提取 10min；再加入 0.5m
13、L 10%乙酸锌溶液和 0.5mL 10%亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，用 1%三氯乙酸定容至满刻度线；样品经 10000rpm，离心 5min；取 5mL上清液作为待净化液。 依次用 3mL 甲醇和 5mL 水活化 SPE 柱；将待净化液用水稀释至 10mL，转移至固相萃取柱，依次用 3mL 水和 3mL 甲醇洗涤，抽至近干后，用 6mL 5%氨化甲醇溶液洗脱。整个过程控制流速不超过 1mL/min。洗脱液 50下用氮气吹干，残留物用 1mL 流动相溶解，涡旋混合，过 0.45m 油系滤膜，供 HPLC 分析。 【仪器与试剂】 UV1201 紫外-可见检测器；P1201 高压恒流泵；ZWII 型
14、色谱柱温箱；Elite MSP 色谱柱(5m，I.D.4.6mm150mm) ；三聚氰胺标准品 (99%)；阳离子交换固相萃取柱(Thermo Retain-CX, 60mg, 3mL)；氢氧化钠、柠檬酸(分析纯) 、辛烷磺酸钠(色谱纯) 、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯) 、乙酸锌( 分析纯) 、亚铁氰化钾(分析纯)、三氯乙酸(分析纯)、氨水(25%) 、超纯水(二次过滤)，各种饲料样品。 【试剂配制】 三聚氰胺标准储备液 称取 50.0mg(精确到 0.1mg)三聚氰胺标准品，用 20%甲醇溶解并定容至 50mL 容量瓶中，该溶液浓度为 1mg/L，于 4 冰箱储存，有效期 3 个月。 使用
15、时，用流动相将储备液分别稀释到不同浓度即可。标准系列工作曲线包括1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、50mg/mL。 1% 三氯乙酸溶液 称取 10.0g 三氯乙酸，加水定容到 1000mL。 10%乙酸锌溶液 称取 10.0g 乙酸锌，加水定容到 100mL。 10%亚铁氰化钾溶液 称取 10.0g 亚铁氰化钾，加水定容到 100mL。 氨水甲醇溶液 量取 5mL 氨水溶液，加入 100mL 甲醇混合均匀。 【分析方法】 色谱柱：Elite MSP 5m(ID4.6mm150mm) 流动相：乙腈/缓冲盐=10/90(缓冲盐含 10mM 柠檬酸和 10mM 辛烷磺酸钠，
16、调节 pH至 3.0) 流速：1.5mL/min 波长：240nm 室温：控制在 2228之间 进样量：20L 【实验结果】 1. 标准品谱图 10mg/L 的三聚氰胺标准品的实验谱图如下： 图 1 10mg/L 标准溶液谱图 2. 重现性 采用此方法分析三聚氰胺，连续进样重现性良好。 图 2 5mg/L 标准溶液连续进样 11 次重现性 表 1 5mg/L 标准溶液连续进样 11 次重现性数据 编号 保留时间/min 峰面积/mVsec 1 14.687 207.21 2 14.679 206.85 3 14.665 206.28 4 14.637 205.23 5 14.638 206.1
17、2 6 14.616 206.36 7 14.586 207.66 8 14.620 207.55 9 14.627 207.84 10 14.659 207.83 11 14.689 207.71 平均值 14.65 206.97 RSD/% 0.23 0.42 3. 线性相关性测试 如图 3、4，在所测试浓度范围内，三聚氰胺标准品具有良好的线性相关性，相关系数均为0.9999。 图 3 不同浓度标准品叠加谱图 图 4 实验的校准曲线 4. 加标回收率 图 5 对比可知，在标准品出峰位置，样品没有明显出峰，故该样品为阴性样品或三聚氰胺含量低于该系统的方法检出限，用此样品做加标回收率实验，结果
18、见表 2。 图 5 未知样品、空白及样品加标叠加谱图 表 2 饲料样品的加标回收率结果 加标量(mg/kg) 平行实验一 (mg/kg) 平行实验二 (mg/kg) 平均值 (mg/kg) 回收率% 1.0 1.05 1.03 1.04 104.0% 5.0 4.36 4.51 4.44 88.8% 10.0 9.63 9.25 9.44 94.4% 25.0 21.97 21.77 21.87 87.5% 如表 2 结果，在 4 个不同的加标水平下，该方法三聚氰胺的加标回收率在 87.5%104.0%之间，说明方法准确性良好。 5. 检测限、定量限 依据噪声值，按 3 倍信噪比，计算其理论检
19、出限，按 10 倍信噪比，计算其理论定量限如下： 计算方法 检出限(mg/kg) 定量限(mg/kg) 校正曲线方法 0.046 0.153 6. 系统稳定性测试 同一饲料加标样品，一分为三，采用所述方法连续处理三次，并测试谱图计算结果，如图6 和表 3 所示。 图 6 样品分析叠加谱图 表 3 平行样品测试结果 平行实验一 (mg/kg) 平行实验二 (mg/kg) 平行实验三 (mg/kg) 平均值 (mg/kg) RSD% 4.36 4.51 4.42 4.43 1.47 同一样品，平行测试 3 次，测试三聚氰胺结果 RSD 值为 1.47%，说明该系统稳定性良好。7. 实际样品定性和定
20、量结果 采用所述方法，对饲料样品进行了分析，谱图如下，结果如表 4。 表 4 饲料实际样品测试结果 样品编号 一 二 三 四 五 六 七 三聚氰胺含量(mg/kg) 未检出 未检出 0.63 25.07 770.47 1.41 未检出 图 7 饲料样品一分析谱图 图 8 饲料样品二分析谱图 图 9 饲料样品三分析谱图 图 10 饲料样品四分析谱图 图 11 饲料样品五分析谱图 图 12 饲料样品六分析谱图 图 13 饲料样品七分析谱图 附件 1：HyperSep Retain-CX 产品介绍 产品名称: HyperSep Retain-CX 填料基质: 磺酸基功能化的聚苯乙烯 /二乙烯基苯萃取
21、柱 规格型号:60mg/3mL 产品货号:60107-303 产品图片: 生产商: Thermo Fisher Scientific 产品特点: 三聚氰胺前处理 碱性、非极性分析物的均可保留 从生物样品中萃取碱性药物的理想选择 附 2：饲料中三聚氰胺检测依利特全套配置清单 测试用分析方法包 序号 名称 规格级别 数量 产地 1 柠檬酸 分析纯 50g 国产 2 辛烷磺酸钠 色谱纯 60g 国产 3 三聚氰胺标准品 纯度99.0% 1 克 美国 4 一次性注射器(200 支/包) 2mL 1 包 国产 5 水系滤膜(100 片/盒) 50mm，0.45m 1 盒 上海 6 有机系滤膜(100 片
22、/盒) 50mm，0.45m 1 盒 上海 7 针筒式有机相过滤器(100 支/包) 13mm，0.45m 2 包 天津 8 Elite MSP 三聚氰胺专用柱 ID:4.6250mm，5m 1 支 依利特 9 混合型阳离子固相萃取柱(50 支/ 盒) HyperSep Retain-CX，60mg/3mL 4 盒 进口 测试用前处理配置包 序号 名称 规格级别 数量 产地 1 超声波水浴 AS3120 型，3L,功率：120W 1 台 天津 2 隔膜真空泵 GM 型 1 台 天津 3 溶剂过滤器 1000mL 1 套 天津 4 分析天平 AL104，感量 0.0001g 1 台 进口 JD6
23、0-4,0.0001g 1 台 沈阳 5 离心机 TG16G，16000 转，650mL 1 台 湖南 TD5G，5000 转，1210mL 1 台 湖南 6 PH 计 FE20K 酸度计 1 台 进口 6010 酸度计 1 台 上海 7 涡旋混合器 QL-861 1 台 江苏 8 固相萃取仪 SPE-12 1 套 天津 9 氮气吹干仪 PGC-01D 1 台 天津 液相色谱仪标准配置包 序号 名称 数量 1 P1201 三聚氰胺测试用液相色谱系统 1 套 P1201 高压恒流输液泵 1 台 UV1201 紫外可变波长检测器 1 台 ZWII 型色谱柱恒温箱 1 套 Rheodyne 7725
24、i 高压六通进样阀 1 支 Elite MSP 三聚氰胺专用柱 1 支 25L 微量进样器 1 支 100L 微量进样器 1 支 ZJ-1 阀及色谱柱安装支架 1 套 EC2006 色谱数据处理系统软件 V1.0 版 1 套 专用工具包 1 套 2 高级配置(更多功能，人性化配置，工作效率更高) P1201S 柱塞清洗单元 1 套 P1201 溶剂管理器(含进口二元脱气机 ) 1 套 AS230 固定体积型自动进样器 1 套 3 升级配置(升级后，可在以后工作中检测多种样品，适用面更广，节约成本) P1201 等度升级梯度配置包 1 套 AS230 可变体积型自动进样器 1 套 备注：如需分析饲料中的三聚氰胺，以上三个配置包所列仪器、试剂，都需配备，缺一不可。【
