1、细胞内蛋白质的分选,主讲人：李志坤,目录,引言 一、信号假说与蛋白质分选信号 二、蛋白质分选的基本途径与类型 三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分选,数量：蛋白质是生命活动的主要承担者。哺乳动物细胞中通常可检测出上万种蛋白质，酵母细胞中也含有5000种以上的蛋白质。合成位置：真核细胞中除线粒体和植物细胞叶绿体中能合成少量蛋白质外，绝大多数蛋白质都是由核基因编码，在游离核糖体上、或糙面内质网膜结合核糖体上合成。,作用部位:蛋白质发挥结构或功能的部位几乎遍布细胞的各种区间或组份。,因此，必然存在不同的机制以确保蛋白质的分选，转运至细胞的特定部位。蛋白质也只有各就各位并组装成结构与功能的复合
2、体，才能参与实现细胞的各种生命活动。这一过程称蛋白质寻靶（protein targeting）或蛋白质分选（protein sorting）。蛋白质分选与组装是涉及多种信号调控的复杂而重要的细胞生物学热点问题。,一、信号假说与蛋白质分选信号,发现历史： George Palade 发现细胞质游离的核糖体产生非分泌蛋白，内质网附着核糖体能产生分泌蛋白。但是细胞学家没有发现能解释两种核糖体功能差异的不同结构。Palade 的学生 Gunter Blobel 假设该差异应存在于蛋白质本身。他和 David Sabatini 推测分泌蛋白可能携带N端短信号序列，可以引导蛋白质的转运。这就是二者在197
3、5年提出的信号假说（singnal hypothesis）。,相继发现的存在信号序列的一些证据：Philip Leder 及其同事构建的无细胞翻译系统产生比正常分泌抗体长68个氨基酸的轻链，其他人也获得相似的结果。在对信号假说不知情的情况下，Cesar Milstein 基于他的无细胞系统提出相似假设。研究人员对微粒体的蛋白质进行检查，发现只存在正常长度的蛋白质。他们假设这多余的氨基酸序列对指导蛋白质转运至内质网有重要的作用。,多数情况下， 微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，它包含内质网膜和核糖体两种基本成分。在体外实验中，具有蛋白质
4、合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。,尽管一些人质疑多出来的蛋白量是体外翻译和分离的错误，但 Blobel 等人设计了一种蛋白质体外翻译-转运系统，获得了一系列信号假说的证据，包括利用鼠的mRNA、兔的核糖体和狗的内质网（胰腺微粒体）组建的翻译-转运系统可能是一个通用系统。研究细胞内蛋白质转运机制的诸多细节花费了20多年时间，其中洛克菲勒大学的 Blobel 在1999年由此获得了诺贝尔生理学或医学奖。,Prize motivation: “For the discovery that proteins have intrinsic signals that govern thei
5、r transport and localization in the cell“.,Gnter Blobel,Blobel 在1971 年首次提出内质网膜分泌蛋白的氨基端序列带有转运信息。这一设想在1975 年扩展为信号假说，1980 年扩展为在细胞内蛋白转运及膜生物合成过程中的普遍学说。发现并分析了某些分泌蛋白、整合膜蛋白、叶绿体、线粒体基质蛋白和溶酶体蛋白的信号序列； 从内质网分离得到了信号识别颗粒SRP； 在线粒体和叶绿体膜上相继分离得到了识别SRP 的受体； 纯化得到了内质网相关的信号肽酶； 用电生理的方法证实了内质网上蛋白运输通道的存在。,现已知，指导分泌性蛋白在糙面内质网上合成的
6、决定因素是由蛋白质N端的信号肽（signal peptide）、信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）和内质网膜上信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白，docking protein，DP）等因子共同协助完成。,信号肽,信号肽位于蛋白质的N端，一般由1626个氨基酸残基组成。原核细胞某些分泌性蛋白的N端也有信号序列。,信号肽似乎没有严格的专一性，如大鼠的胰岛素原蛋白接上真核或原核细胞的信号肽，均可通过大肠杆菌的细胞质膜分泌到细胞外。,信号肽的一级结构序列,发现信号肽序列之后，人们有相继发现一系列蛋白质分选信号序列，统称信号序列（signal sequence
7、）。有些信号序列还可形成三维结构的信号斑（signal-patch）。,信号识别颗粒,信号识别颗粒是一种核糖核蛋白复合体。由6种不同的蛋白质和一个由300个核苷酸组成的7S RNA结合组成。,SRP通常存在于细胞质基质中，等待信号肽从多核糖体链上暴露出来，SRP既可与新生肽信号序列和核糖体大亚基结合，又可与内质网上的SRP受体（DP）结合。,SRP受体,SRP受体（DP）是内质网膜的整合蛋白，相对分子质量为7104，由和亚基组成，可特异与SRP结合。当SRP的p54亚基和DP的亚基与GTP结合时，会增进SRP/新生肽/核糖体复合物与SRP受体结合的强度。,应用体外非细胞系统（cell free
8、 system）进行蛋白质合成实验，证实分泌性蛋白向rER（微粒体）腔内的转运是同蛋白质翻译过程耦联进行的。,这种分泌蛋白在信号肽的引导下，边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运（cotranslational translocation）,分泌性蛋白的合成与其跨越内质网膜的共翻译转运,引导新生肽链穿过内质网膜移位子的信号肽可视为开始转移序列（start transfer sequence）。肽链中还可能存在某些内在序列与内质网膜有很强的亲和力从而使之结合在脂双层中，这段序列不再转入内质网腔中，称之为内在停止转移锚定序列（internal stop-transfer anchor sequenc
9、e，STA）和内在信号锚定序列（internal signal-anchor sequence，SA）。,内质网膜整合蛋白的拓扑学类型,线粒体、叶绿体中绝大多数蛋白以及过氧化物酶体中的蛋白也是在某种信号序列的指导下进入这些细胞器中的。为了研究方便，有人将这种信号序列称之为导肽（leader peptide），其基本特征是蛋白质在基质中合成以后再转移到这些细胞器中，因此称这种翻译-转运方式为后翻译转运（post-translational translocation）。这种转运方式在蛋白质跨膜的过程中不仅需要消耗ATP使多肽去折叠，而且还需要一些分子伴侣蛋白的帮助（如热休克蛋白Hsp70），以帮
10、助蛋白正确折叠形成有功能的蛋白质。,（一）共翻译转运途径：蛋白在信号肽的引导下，边翻译边跨膜转运的过程。 （二）后翻译转运途径：蛋白质在基质中合成以后再转移到靶细胞器中。,二、蛋白质分选转运的基本途径与类型,核基因编码的蛋白质的分选大体可分为2条途径：,酵母中有些分泌蛋白不是像大多数真核细胞那样边合成边跨膜转运，而是由结合ATP的分子伴侣Bip蛋白（Bip-ATP）与膜整合蛋白Sec63复合物相互作用，水解ATP提供动力驱动后翻译转运途径,即分泌蛋白在细胞质基质游离核糖体上合成，然后再转运至内质网中。,根据蛋白质分选的转运方式或机制不同，又可将蛋白质转运分为4类,（一）蛋白质的跨膜转运（tra
11、nsmembrane transport）：主要指共翻译转运途径中，在细胞质基质中起始合成的蛋白质，在信号肽-SRP介导下转移至内质网，然后边合成边转运或进入内质网腔或插入内质网膜；此外是指后翻译转运途径中，在细胞质基质核糖体上完成合成的多肽链在不同靶向信号序列的指导下，依不同的机制转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器。,（二）膜泡运输（vesicular transport）:蛋白质被不同类型的转运膜泡从糙面内质网合成部位转移至高尔基体进而分选转运至细胞的不同部位，其中涉及供体膜出芽形成不同的转运膜泡、膜泡运输以及膜泡与靶膜的融合等过程。,（三）选择性的门控转运（gated trans
12、port）：在细胞质基质中合成的蛋白质通过核孔复合体在核-质间双向选择性地完成核输入或核输出。,（四）细胞质基质中的蛋白质转运：上述几种分选类型也涉及蛋白质在细胞质基质中的转运，这一过程显然与细胞骨架系统密切相关，但由于细胞质基质的结构尚不清楚，因此对其中的蛋白质转运特别是信号转导途径中蛋白质分子的转运方式了解甚少。,三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过 氧化物酶体的分选,和共翻译转运途径中分泌蛋白或内质网膜蛋白N端信号肽引导序列定位于内质网不同，后翻译转运途径中转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质分选是一个多步过程，需要多个不同的靶向序列（targeting sequence）。,定
13、位到叶绿体的前体蛋白N端具有4050和氨基酸组成的转运肽（transit peptide），用以指引多肽定位到叶绿体并进一步穿过叶绿体被膜进入基质或类囊体中。 转运到线粒体和过氧化物酶体的蛋白质与此类似，但靠的是不同的引导序列，即线粒体蛋白N端的导肽或过氧化物酶体蛋白C端的内在靶向序列。,至于这些细胞器蛋白最终是定位在不同的膜上还是不同的基质空间，除N端不同转运肽外，还需要其他空间定位信号序列。,此外，通过后翻译转运途径进入线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质，也必须在分子伴侣的帮助下解折叠或维持非折叠状态，这有利于通过膜上的输入装置，蛋白质输入这些细胞器通常是需要能量的过程。,(一)
14、蛋白质从细胞质基质输入到线粒体,蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质：所有线粒体基质蛋白 端靶向信号序列虽然不尽相同，但共享相同的基序（motif），由2050个氨基酸残基组成，富含疏水氨基酸，带正电荷的碱性氨基酸（Arg、Lys）和羟基氨基酸（Ser，Thr），缺少带负电荷的氨基酸（Asp，Glu）。,这样的氨基酸组成有利于基质蛋白的靶向信号序列形成两性的螺旋构象，并且实验表明，两性的N端靶向信号序列对于指导蛋白质输入线粒体基质是至关重要的。,蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质,蛋白质以3种途径从细胞质基质输入到线粒体内膜：,Oxa1是一种与细菌中涉及内膜蛋白插入的相关蛋白，由线粒体基因组编码
15、， 在线粒体基质核糖体上合成。,间隙蛋白（Tim9/10）被认为起分子伴侣的作用，协助输入蛋白在外膜和内膜 通道之间的转运。,线粒体蛋白通过两种途径从细胞质基质输入到线粒体膜间隙,途径A是从细胞质基质输入到线粒体内膜间隙的主要途径，其过程与内膜蛋白途径A类似，但主要不同是蛋白质内在靶向序列预定其定位于膜间隙。,（二）叶绿体基质蛋白与类囊体蛋白的靶向输入,叶绿体结构比线粒体还要复杂，除外膜、内膜、叶绿体基质以外，还有相对独立的类囊体空间。 由核基因编码的叶绿体基质蛋白包括：所有的Calvin循环有关的酶和核酮糖1,5-二磷酸羧基歧化酶（rubisco）的小亚基，它们都是在细胞质基质合成后输入到叶
16、绿体基质的。 这些前体蛋白均具有N端基质输入序列（stromal-import sequence），向叶绿体基质靶向运输过程和线粒体基质蛋白输入基本类似，区别在于：叶绿体不产生跨内膜的电化学梯度，因此ATP水解供能几乎是唯一动力来源。,定位在类囊体膜和类囊体腔的许多蛋白与光和作用相关，其中大多数是在细胞质基质中以前体形式合成的，并含有多个靶向序列。,例：质体篮素前体蛋白和金属结合前体蛋白,转运蛋白SeeY,蛋白质进入叶绿体基质后两种转运途径：SRP依赖途径和pH依赖途径,（三）过氧化物酶体蛋白的分选,与线粒体和叶绿体不同，过氧化物酶体是真核细胞中唯一利用分子氧氧化底物形成小分子用于合成途径的细胞器，它不含自身的DNA及核糖体，因此所有蛋白质都是由核基因编码，在细胞质中合成的，然后输入到预存或新增殖产生的过氧化物酶体中。,可溶性细胞质受体识别并结合具有C端SKL（Ser-Lys-Leu）序列的基质蛋白将其靶向运输到过氧化物酶体的基质中。,可溶性Pex5受体和膜结合的Pex14受体似乎与SRP和SRP受体的功能有相似性。,基质蛋白-Pex5受体复合物通过定位在过氧化物酶体膜上的一组蛋白质复合物（Pex10/12/2）以尚不清楚的机制转运到基质中。,信号序列不被切除,过氧化物酶体基质蛋白的输入,谢谢,
