1、丹酚酸 B 的水解动力学及降解机理郭永学，张华，董悦生，修志龙*大连理工大学环境与生命学院 生物科学与工程系 大连 116024摘要：目的 研究丹酚酸 B 的水解动力学特征和降解机理。方法 运用 HPLC定量分析丹酚酸 B，运用 LC-MS 及 NMR 检测丹酚酸 B 的水解产物，推测其降解途径。结果 丹酚酸 B 降解符合一级动力学特征，降解速率随缓冲盐浓度的增加，温度的升高而加快，pH-速率图是 “S”型曲线，在 pH2.0 时最为稳定。 1H(13C)-NMR 鉴定结果表明，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸 E、紫草酸和紫草酸异构体等是丹酚酸 B 的降解产物。结论 得出了丹酚酸 B 的水解
2、动力学特征，初步推断了丹酚酸 B 的降解机理。关键词：丹酚酸B；水解；动力学；降解机理； LC/MS Hydrolysis Kinetics and Degradation Mechanismof Lithospermic Acid BGuo Yongxue，Zhang Hua，Dong Yuesheng，Xiu Zhilong*Department of Bioscience and Biotechnology,School of Environmental and Biological Science and Technology, Dalian University of Technol
3、ogy, Dalian 116024,ChinaABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the kinetics and mechanism of degradation of lithospermic acid B (LAB) in aqueous solution. METHODS High performance liquid chromatography (HPLC), liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) were empl
4、oyed. RESULTS The degradation follows pseudo-first-order kinetics under all experimental conditions. The results indicated that the degradation rate increased with 作者简介：郭永学，男，博士生 通讯作者：修志龙，男，博士生导师 Tel：（0411）84706369Email：the increase of buffer concentration and temperature. The pH-rate profile shows
5、a characteristic S-shape, and the maximum stability was obtained at pH 2.0. Six degradation products including danshensu, protocatechuic aldehyde, caffeic acid, savianolic acid E, lithospermic acid and its isomer I were separated and identified by 1H(13C) NMR analysis. CONCLUSION The characters of k
6、inetics and mechanism of degradation of LAB in aqueous solution were studied. The primary degradation pathway of LAB is proposed.KEY WORDS：Lithospermic acid B; Hydrolysis; Kinetics; Reaction mechanism; LC/MS丹参是唇形科植物丹参( Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎，是味传统中药，具有“ 袪瘀止痛，活血通经、清心除烦”等功效 1。丹酚酸 B 是丹参的主要水溶性成
7、分，含量丰富（占干重的 2-8%，约占丹参中总酚酸质量的 54%） ，在抗氧化、清除自由基、保护心脑血管缺血再灌注损伤方面有较强的生物活性2,3。图 1 丹酚酸 B 的分子结构（分子式：C 36H30O16，分子量：718）Fig. 1 Structure of LAB (M.F. C36H30O16, M.W. 718)从分子结构上看，丹酚酸 B 是由两分子丹参素和一个分子咖啡酸二聚体以酯键缩合而成的低聚物，在水溶液中不稳定。王凤美 4等在研究样品处理方法对丹酚酸 B 的影响时发现用微沸的水提取丹酚酸 B 时，其含量先增大后降低。倪力军 4,5等在研究加热方式对缩合酚酸影响时，发现丹酚酸 B
8、 对温度很敏感，加热方式不同，提取液中丹酚酸 B 的含量相差 1 倍以上。张军 6等研究发现丹酚酸 B 不仅对温度敏感，还对 pH 敏感，丹酚酸 B 在 pH2 时比较稳定，在pH12 时短时间内就迅速消失。曲桂武 7等研究了不同添加剂对水溶液中丹参酚酸 B 的影响，结果表明，酸性添加剂对溶液中丹酚酸 B 的保护作用明显好于碱性或中性添加剂,其中以抗坏血酸的保护效果最佳。由此可知，影响丹酚酸 B 热稳定的因素主要是温度和 pH。但到目前为止，未见有关丹酚酸 B 降解规律及其降解途径的报道。本文以物理药剂学中反应动力学和热为学为理论基础，以 HPLC，LC-MS和 NMR 为分析手段，系统研究了
9、丹酚酸 B 在高温加速实验条件下的水解动力学特征与降解机理。1.材料与方法1.1 主要仪器与试剂高效液相色谱仪（Agilent 1100 系列） 。TSQ 三级四极杆质谱仪（Finnigan ） 。半制备型高效液相色谱（岛津（SHIMADZU）LC-6AD） 。分析 LC-MS （Waters2690 分离单元，Waters996 二极管阵列检测器，Waters Millennium32 色谱工作站，Finnigan TSQ 三级四级杆质谱仪，Hypersil AA-ODS 色谱柱） 。核磁共振仪（Bruker 400HZ）甲醇、乙腈（色谱纯， TEDIA） 。其它试剂均为分析纯，水为 Mil
10、lipore 制备超纯水。丹参（河北省安国县丹参药材基地） 。丹参素、原儿茶醛和丹酚酸 B 标准品（含量均不低于 98.5%，中国药品生物制品检定所） 。1.2 HPLC 分析方法色谱柱 Hypersil AA-ODS C8 (150mm 4.6mm, 5m)；柱温箱温度：30 oC；检测波长为 288 nm；洗脱流速为 1.0 mL/min；进样量是 10L；流动相由A：1%(v/v)，醋酸水溶液和 B：乙腈-甲醇(3:2, v/v)组成，梯度洗脱程序见表1。表 1 梯度洗脱表Tab.1 Gradient program of the mobile phase1.3 HPLC-ESI/MS
11、分析方法色谱条件同上，ESI 离子源 m/z 扫描范围为 1201200；扫描周期是 1s；离子喷雾电压选择 4.5KV；毛细管温度是 325；夹套气（N 2）流量为 40psi；辅助气（N 2）流速是 20Arbitary units；检测方式选择负离子检测。1.4 丹酚酸 B 水解过程以丹参制取含量为 70%的丹酚酸 B 样品，称样品 100mg，用 pH2.0 的去离子水定容于 10mL 的容量瓶中，保存在 4冰箱中。每次实验时，取 40l 加入到装有 960L 相应缓冲溶液的反应器中，密封， 900.5的恒温加热。根据预反应结果，当反应物浓度下降为原浓度约 10%时，取出 40L，迅速
12、冷却以中止反应，冰中保存，在 6h 内进样 10L 分析。1.5 离子强度对反应速率的影响根据碰撞理论，凡在溶液中进行的反应会受到离子强度的影响。为了排除由于离子强度不同给反应速率造成的影响，用 NaCl 调节离子强度到 0.5M。1.6 pH 和缓冲盐对反应速率的影响为了维持相对稳定的 pH，水解实验是在缓冲溶液中进行的。实验中选择了醋酸盐和磷酸盐缓冲溶液，在 pH 0.4-1.27 用 HCl-NaCl；pH 2-3.0 用 H3PO4-NaH2PO4；pH 3.5-5.5 用 HAC-NaAC； pH 6.0-7.0 用 Na2HPO4-NaH2PO4。为了正确判断 pH 对丹酚酸 B
13、降解速率的影响，首先要排除缓冲盐的影响。在每个pH 下，测定三个缓冲盐浓度（0.048，0.096，0.192M）下的速率常数。1.7 温度对反应速率的影响实验中其它条件保持一定的情况下，在 pH 0.93 和 2.0 两点考察了温度影响，为了保证用 Arrhenius 方程外推的正确性，实验中选择的温度范围比较宽，包括50、60、70、80 和 90。2. 结果与分析2.1 丹酚酸 B 的水解对于一级反应，有以下特征：或 （1）tkCobst0ln)ln(10tobsC其中，C 0,Ct 分别是反应起始时刻与 t 时刻的反应物浓度，t 为反应时间，kobs 为反应速率常数。丹酚酸 B 的浓度
14、总是随着水解时间呈指数性下降，呈现出一级反应的特征。从丹酚酸 B 的起始浓度 C0 和 t 时刻的浓度 Ct 可以算出丹酚酸 B 的降解速率常数 kobs，一级反应的另一重要特征是速率常数的量纲为（时间） -1。对丹酚酸 B降解实验的所有数据用公式 1 进行拟合，发现丹酚酸 B 的浓度剩余率的自然对数 ln(Ct/C0)和时间存在良好的线性关系，相关系数均大于 0.95。部分一级动力曲线见图 2。图 2 90C 丹酚酸 B 在缓冲溶液中的一级动力学曲线Fig.2 Pseudo-first-order plots for the hydrolysis of LAB in buffer solut
15、ions at 90C从图 2 可知，在浓度为 0.05mol/L 的缓冲盐溶液中，丹酚酸 B 在不同 pH下的降解均符合一级动力学特征。2.2 缓冲盐浓度对反应速率的影响丹酚酸 B 的降解速率随缓冲盐浓度的变化情况见图 3。图 3 缓冲盐浓度对丹酚酸 B 反应速率的影响(a)磷酸盐（b）醋酸盐，图中数值为溶液的 pH从图 3 可知，无论在磷酸缓冲溶液中(Fig.3a)，还是在醋酸缓冲溶液中(Fig.3b)，反应速率常数 kobs 均随着缓冲盐的浓度增大而增大。2.3 pH 对反应速率的影响对于一个液体制剂而言，pH 是影响药物降解速率的重要因素之一，也是药物稳定性研究中关注较多的一个参数。这
16、类反应的反应速率常数可用以下公式来表示：kobs=kPH+kbB （2）其中，常数 kobs 是丹酚酸 B 降解的表观速率常数，kpH 是特殊酸碱催化速率常数，kb 是一般催化剂的催化速率常数 由公式 2 可知，对于一个 pH 确定的反应，图 3 的曲线外推至缓冲盐浓度为零时，就得到了排除缓冲盐影响的速率常数 kpH，它表示反应只受特殊酸碱催化的速率常数。将一系列外推得到的速率常的 logkpH 对 pH 绘图，就得到了消除缓冲盐影响的 pH-速率曲线图 4。图 4 丹酚酸 B 的 pH-速率曲线Fig.4 pH-rate profile of LAB从图 4 可知，丹酚酸 B 的降解 pH-
17、速率曲线符合药剂稳定性研究中常见的“S”型曲线，而且在 pH 4.5-6.0 之间有一个“拐”点，在 pH 2.0 时，丹酚酸 B 最为稳定，而当 pH2.0 时，随着 pH 的增加，丹酚酸 B 的降解速率明显加快，表明碱催化成为主要因素。2.4 温度对反应速率的影响在其它条件保持一定的情况下，丹酚酸 B 在不同温度下的降解速率见表2。表 2 温度对丹酚酸 B 降解速率的影响Tab.2 Effect of temperature on rate of LAB hydrolysis从表 2 可知，丹酚酸 B 的降解速率随着温度升高而增大，为了定量描述这种影响，引入经典的 Arrhenius 公式
18、（3）RTEAkaobslnl其中： A 是指前因子，Ea 丹酚酸 B 降解反应的表观活化能，R 是理想气体常数（8.314Jmol -1K-1）,T 是绝对温度实验 Arrhenius 曲线见图 5：图 5 丹酚酸 B 降解的 Arrhenius 曲线图Fig.5 Arrhenius plots of LAB 从图 5 可知，丹酚酸 B 的降解速率随温度升高而增大，在 pH2.0 时，丹酚酸 B 的降解速率受温度影响相对较小。还可以看出，温度对丹酚酸 B 的降解速率的影响在 70C 发生了转折，这种现象表明丹酚酸 B 降解 Arrhenius 方程中的指前因子 A 是具有温度依赖性的。2.5
19、 丹酚酸 B 的水解产物丹酚酸 B 在 90水解一定时间后的降解产物见图 6。图 6 丹酚酸 B 及其水解产物的 HPLC Fig.6 HPLC of salvianolic and its hydrolysis products从图 6 可知，丹酚酸 B 的水解产物较多，用 HPLC 制备了 6 种含量相对较多丹酚酸 B 的水解产物，并用 LC-MS 和 NMR 特别是二维谱，做了鉴定，它们分别是丹参素（Danshensu） 、原儿茶醛（Procatechuic aldehyde） 、咖啡酸(Caffeic acid)、丹酚酸 E(Salvianolic acid E)、紫草酸(Lithos
20、permic acid )和紫草酸异构体(Isomer of lithospermic acid)，结构见图 7。图 7 丹酚酸 B 及其降解产物Fig.7 Lithospermic acid B and its degraded products 2.6 丹酚酸 B 降解机理（1） 丹酚酸 E 产生的途径丹酚酸 E 是丹酚酸 B 降解过程中的一个重要的中间产物，根据丹酚酸 B 呋喃环结构特性，推测丹酚酸 B 经酸催化、开环、脱水形成丹酚酸 E，具体过程如图 8。图 8 丹酚酸 E 的产生机理Fig.8 Proposed formation pathway of salvianolic aci
21、d E from salvianolic acid B（2）其它水解产物产生机理推断出丹酚酸 E 后，结合丹酚酸 B、E 的酯键结构，推断其它产物产物产生机理如图 9。图 9 丹酚酸 B 的降解途径Fig. 9 The degradation pathway of LAB从图 9 可知，丹酚酸 B 是通过酯水解和苯并呋喃环开环反应进行降解。总的来说，丹酚酸 B 主要反应位点有 3 处，分别是 2 个酯键与 1 个呋喃环；主要反应类型是呋喃环开环和酯水解。 3. 讨论丹酚酸 B 的降解符合一级动力学特征，其降解速率受下列因素影响：丹酚酸 B 的降解速率随缓冲盐浓度的增加而增大，随着温度的升高而加
22、快。溶液 pH 是影响丹酚酸 B 降解的最主要因素，丹酚酸 B 的 pH-速率曲线是带有“拐点”的“S” 型曲线。对 pH-速率曲线的拟合结果表明，丹酚酸 B 的在 pH2时最为稳定，pH2 时，丹酚酸 B 的降解速率随着 pH 的增大而增大。因此，丹酚酸 B 提取过程中宜缩短受热时间，并控制提取液 pH。丹酚酸 B 降解反应是一个复杂的反应体系，以丹酚酸 B 为反应物有 3 个平行反应，每个反应又包含多级连串反应，在一定时间内，中间产物能达到一定程度的平衡，存在多种物质之间的单向转化。总的趋势是丹酚酸 B，丹酚酸E、紫草酸及其异构体的含量在下降，而丹参素、咖啡酸和原儿茶醛含量在不断增加。因此
23、，对丹酚酸 B 为主的制剂，应联合控制丹酚酸 B 含量下限和丹参素、原儿茶醛含量上限，以全面反映制剂质量。REFERENCES1 National Pharmacopoeia Committee，Pharmacopoeia of Peoples Republic of China，vol1，Chemical Industry Press, Beijing，2005，p522 TYOKOZAWA，CHUNG HY，DONG E，et alConfirmation that magnesium lithospermate B has a hydroxyl radical-scavenging ac
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25、search and Practice of Chinese Medicines，2004,18：62-64 5 NI LJ，GU H XGAO XJ et al，A New Technology of Etracting Salvianolic Acid B from Salvia Miltiorrhiza BungeJJounal of East China University of Science and Technology(National Science Edition)，2006，08：964-9666 NI LJ，WU KF，ZHANG LG，et al，Influence
26、of Heating Method on the Quality of Extracts from Radix Salviae MiltiorrhizaeJTraditional Chinese Drug Research&Clinical Pharmacology， 2006，17(1)：55-577 ZHANG J，WANG FY，ZHANG LL，et al，Influence Factors on the Stability of Lithospermic Acid B in Aqueous SolutionJChina Journal of Chinese Materia Medic
27、a， 2005，30(10)：789-7908 QU G，YUE XD，LI GS，Influence of Additive on the Stability of Lithospermic Acid B in Aqueous SolutionJChinese Traditional and Herbal Drugs，2005，36(11) ：1654-1655表 1 梯度洗脱表Tab.1 Gradient program of the mobile phaseTime (min) A % B%0 80 2015 70 3025 70 3027 80 2035 80 20表 2 温度对丹酚酸
28、 B 降解速率的影响Tab.2 Effect of temperature on rate of LAB hydrolysis反应速率常数（h -1） 1温度 1/T(K-1)pH=0.93 r pH=2.0 r90 0.002754 0.0693 0.9928 0.0433 0.996080 0.002832 0.0436 0.9963 0.0276 0.980070 0.002914 0.0236 0.9890 0.0186 0.993260 0.003002 0.00874 0.9970 0.00765 0.998450 0.003095 0.00414 0.9907 0.00391 0
29、.9983图 1 丹酚酸 B 的分子结构（分子式：C 36H30O16，分子量：718）Fig. 1 Structure of LAB (M.F. C36H30O16, M.W. 718)048121620-2.0-1.5-1.0-0.50. pH0.35 .6 p1.20 H. p3.0 4. pH5.0 6. p7.0ln (Ct/0) Time(h)图 2 90C 丹酚酸 B 在缓冲溶液中的一级动力学曲线Fig.2 Pseudo-first-order plots for the hydrolysis of LAB in buffer solutions at 90C.489614192
30、0.0.20.40.60.81.01.24896141920.50.10.150.20.250.30.350.40.45kobs(h-1) bufer conetraion (mM)ab7.056.56.0 5.5.04.4.03.53.02.5图 3 缓冲盐浓度对丹酚酸 B 反应速率的影响(a)磷酸盐（b）醋酸盐，图中数值为溶液的 pHFig.3 Effect of buffer concentration on hydrolysis rate of LAB(a) phosphate, and (b) acetate, parameter in figure described as sol
31、ution pH012345678-1.6-.4-1.2-.0-.8-0.6-.4-0.2.logkpHpH图 4 丹酚酸 B 的 pH-速率曲线Fig.4 pH-rate profile of LAB2.72.82.93.03.13.2-6-5-4-3-2 pH2.0 .93lnkobsTemprature(T-1K-3)图 5 丹酚酸 B 降解的 Arrhenius 曲线图Fig.5 Arrhenius plots of LAB 024681012141618202LAB15 92 83 764 110Time (in)02040 608010Relative Abundance图 6 丹
32、酚酸 B 及其水解产物的 HPLC Fig.6 HPLC of salvianolic and its hydrolysis productsCOHOHDanshensu(M.W.198)A1OHHO23456789 COHCafeic aid(M.W.180)A1OHHO23456789 CHOProtcatechuic aldehyde(M.W.138)A1OHHO234567Lithospermic aid(M.W.538)A1HO23456789OCOHHOOHOOCOHOHOHBC12345678 12345678Salvianolic aid E(M.W.718)A1HO23456
33、789HOHOOHOOCOHOHOHBC12345678 12345678OCHOHOH12345678999DLithospermic aid B(M.W.718)A1HO23456789OHOOH OOCOHOHOHBC12345678 12345678OCHOOHOH12345678999DIsomer of lithospermic aid(M.W.538)A1HO23456789HOHOOHOHOC12345678OCHOHOH1234567899D图 7 丹酚酸 B 及其降解产物Fig.7 Lithospermic acid B and its degraded products
34、OHOHOOHOOHC OHOHOOCOHOHOHH+ +HOHOHOOHOOHC OHOHOOCOHOHOHHOHOHOOHOOHC OHOHOOCOHOHOHHOHOOHOOHC OHOHOOCOHOHOH+H2OHO +HOHOHOOHOOHC OHOHOOCOHOHOHHOHOOHOOHC OHOHOOCOHOHOHOHOSalvianolic acid B(M.W.718)Salvianolic acid E(M.W.718)+H+H2O-H+-H2O图 8 丹酚酸 E 的产生机理Fig.8 Proposed formation pathway of salvianolic acid
35、 E from salvianolic acid BOHOHOOHOOHOC OHOHOOCOHOHOH14327891347 89 8“ 81 349 9 4317 HOHOHOOHOOHOC OHOHOOCOHOHOH14327891347 89 8“ 81 349 9 4317OHOHOOHOOHOC OHOHOOH OHOHOOHOOHOOCOHOHOHOHOHOOHOOHOOHHOHOHOOHOOHOC OHOHOOH HOHOHOOHOOHOOCOHOHOHHOHOHOOHOOHOOHLAB (M.W. 718) Salvianolic acid E (M.W. 718)Isomer 1 (M.W. 538) Lithospermic acid (M.W. 538)Prolithospermic acid (M.W. 358)Isomer 2 (M.W. 538) Isomer 3 (M.W. 538)Cafeic acid imer (M.W. 358)H+HOCOHOHOHDSU (M.W. 198)DSU DSUDSUDSUDSUDSU DSUDSUHOHO OOHCafeic acid (M.W. 180)图 9 丹酚酸 B 的降解途径Fig. 9 The degradation pathway of LAB
