1、细胞因子、抗体检测技术,刘 新 建卫生部抗体技术重点实验室,背景知识,研究细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和指导临床治疗均具有重要意义。抗体具有高特异性、高亲和力等特点，目前已广泛应用于免疫学、微生物学、肿瘤学、遗传学以及分子生物学等各个领域。,细胞因子的检测方法：1) 生物学方法 依赖性细胞株 ：生物分析法 功能检测 ：生物分析法 2) 分子生物学方法 分子杂交技术 ：mRNA的测定 多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定 3）免疫学方法 免疫测定 ：免疫酶技术功能测定与抗体抑制,抗体检测技术1）免疫酶技术2）免疫荧光技术 3）间接血凝试验 4）放射免
2、疫测定5）蛋白印迹6）免疫共沉淀,酶联免疫吸附测定 (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay,该试剂盒是基于NP30抗独特型抗体可替代虫源性 抗原的特性研制而成的。在国内、外均属率先应用生 物技术制备抗原代替传统虫源抗原。已证实NP30检测 的血吸虫抗体属短程抗体，治疗后阴转较快，具有疗 效考核价值。 该试剂盒的诊断效能多项指标均已达到或超过经 典抗体检测法，较以前病原学检查和免疫学检测方法 更为简便快速。仅用一滴血，20分钟即可判读结果， 不需其他仪器设备，便于在基层、现场使用。本试剂 盒已在血吸虫流行区已应用近120万人次。,实验原理,酶联免疫吸附
3、测定是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫技术，此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速，因其具有微量、特异、高效、经济、方便和安全等特点，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。,实验原理,ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体。 1、使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 2、使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 3、按一定步骤进行抗原抗体反应。 4、加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,方法类型,ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标本性状以
4、及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法。1.直接法2.间接法3.双抗体夹心法4.双夹心间接法,一、试剂及仪器准备, 免疫吸附剂 固相载体 要求： 吸附力强 能保持Ag或Ab活性 不参与化学反应 载体性能比较 载体材料：+、- 结果差别大 ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10%。, 常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等形状：小试管、小珠、微量反应板 2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法 封闭：包被后在用15%小牛血清白蛋 白再包被，
5、以消除非特异吸附的干扰。, 酶结合物： 1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。 2. ELISA常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2：荧光HRP不可溶性底物及呈色：DAB(棕黄色) -萘酚(红色)，3-氧基-9-乙基卡唑(红色)4-氯-1-萘酚(灰蓝色),AP可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光AP不可
6、溶性底物及呈色：NBT和BCIP混合液：紫色坚固红和萘酚ASMX混合液：红色-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-半乳糖苷：荧光 4. 酶结合物的制备： 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法,（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。操作时室温宜在15-30，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶
7、标仪可用双波长式测读。,二、操作步骤 （间接ELISA法）,1.样本的收集； 2.包被抗原； 3.封闭； 4.加稀释的待检样品； 5.加酶标抗抗体； 6.加底物显色； 7.终止反应。,（一）样品的收集和保存：,1. 溶血标本可增加非特异性显色(Hb作用于HRP的辅基)；2. 细菌污染标本因菌体内源性酶而假“-”(破坏Ag或Ab)或假“+”(非特异蛋白)；3. 反复冻融可使抗体效价下降而假“-”；4. 陈旧标本可使IgG聚集，引起间接法本底增加；5. 标本中含NaN3，可出现假“-”。,（二）包被,将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠
8、的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,包被的条件pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCl缓冲液。加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜或37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,最适工作浓度的选择可用棋盘滴定法在夹心ELISA法中选择包被抗体和酶标抗体工作浓度，即利用棋盘滴定，
9、将包被抗体和酶标抗体稀释成一系列浓度，反应后显色。阳性值在0.8左右，阴性值小于0.1为最适，可据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度,方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为08左右，阴性参考血清A值01的包被抗原稀释度为工作浓度。,（三）封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相
10、关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。,（四）加样,抗原或抗体： 纯化抗原/抗体(天然但干扰多)、 合成抗原/抗体(多肽分子较小，常有空间位阻)、 基因抗原(与片段的选择和制备水平有关),对照设定,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相
11、称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。,（五）加酶标抗体,即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。,（六）显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助
12、于加速显色进行。TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。,（七）结果判定,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，
13、A），两者含义相同。通常的表示方法是将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为“A492nm“或“OD492nm“。,1. 定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔,2.定量测定ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难
14、达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。,三、基本操作注意事项,（一）加样:在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,（二）孵育ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中
15、常用的孵育温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,（三）洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELISA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,四、实验中常出现的问题,1. ELISA出现“一片黄”的原因：酶结合物浓度过高底物不新鲜洗涤不干净 2.ELISA出现“一片白”的原因：载体吸附性能差 底物错稀释液作包被液加错试剂包被时间过短酶活力低或下降样品含有NaN3。,间接ELISA法操作步骤,1.样本的收集； 2.包被抗原； 3.封闭； 4.加稀释的待检样品； 5.加酶标抗抗体； 6.加底物显色； 7.终止反应。,实验报告,内容：实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、讨论与分析 要求：只接受纸质、手写体报告。,样本收集,包被抗原,封 闭,加入待检样品，10min,洗涤3次,加入酶标二抗，10min,洗涤3次,洗涤3次,加入显色液3、4液各一滴,洗涤8次,已完成,未完成,
