1、重组细胞因子概述一、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。二、细胞因子的特征1、低分子量；一般为60kD 的多肽或糖蛋白。多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。
2、3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。三、细胞因子的分类 1、白细胞介素(interleukin，IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。 2、干扰素（interferon,IFN)最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。分 、 和 g 三种类型。 3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)1975 年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。 4、集落刺激因子(colony-stimulating f
3、actor，CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。包括 G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素(TPO)等。5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。根据趋化因子近 N 端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量，可分为 CC、CXC、C、CX3C 四个亚家族。 6 生长因子(growth facto
4、r，GF)生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。四、细胞因子的生物学活性1.介导自然免疫、参与抗肿瘤和抗感染 2.调节 T、B 细胞活化、生长和分化，介导细胞免疫和体液免疫 3.刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞 4.在炎症、感染和内毒素血症中的作用 5.在超敏反应和自身免疫病中的作用 6.细胞因子通过激活其相应受体（CKR），导致细胞的增殖与分化或分泌某种蛋白质。五、 四种蛋白表达体系比较表达 细胞 优点 缺点原核 E. coli 繁殖快、成本低、产量高遗传背景及基因表达调控机制清楚易于大规模培养，成本低廉蛋白常为包涵体，纯化困难 无糖基化（分泌蛋白，细胞膜上
5、蛋白不可用），生物活性不定 无翻译后修饰，内毒素含量高酵母 Pichia 使用简单，表达量高，His-tag 便于纯化，一定的翻译后加工可进行糖基化修饰，操作简单，适合大规模生产 可诱导表达，也可分泌表达，产物便于纯化有时会出现蛋白切割问题糖基化不能满足要求昆虫 High-5 产量高 ，翻译后加工与哺乳动物相似 对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势 无内毒素污染蛋白活性不如哺乳动物 适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白哺乳 CHOHEK293完善的翻译后加工，活性接近天然蛋白 周期长、技术要求高 表达产量低六、 生物学活性质控 不同的细胞因子用不同的方法进行相应的体外（in vitro）或体内（
6、in vivo）活性检测。 重组细胞因子活性通常会以 ED50（半数有效浓度）或 units（活性单位）来标识。因此 1mg 细胞因子中所含的活性单位（units）可以理解为将 1mg/ml 细胞因子原液稀释成 ED50 的稀释倍数 注：ED50 (半数有效浓度): 可诱导 50%最大反应的细胞因子浓度 1) ED50=1.0ng/ml, 则 1.0 ng/ml 相当于 1 unit; 2) 1mg PDGF-BB 中含有多少个 units 呢? Units=1mg/1.0 ng/ml=106 3)若测定的 ED50 为 0.5ng/ml 对应比活性为： 1mg/0.5ng/mg=2X106七
7、、纯度测定 纯度：由以下方法测定纯度大于 95.0%（a）高效液相色谱（SEC-HPLC）；（b）还原和非还原银染 SDS-PAGE。SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂变性凝胶电泳： 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS 溶液中，与 SDS 分子按比例结合，形成带负电荷的 SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于 SDS 与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度
8、取决于分子大小。非变性凝胶电泳：非变性凝胶里面没加变性剂。非变性胶跑出来的蛋白能保持其活性一般用做功能试验，如 EMSA。由于没有变性剂的原因非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的影响，因此对蛋白等电点的确定和缓冲液的酸碱性有注意，有时需要倒转电泳时的正负极。从跑的胶来看，变性胶会比较好看，带比较窄，非变性胶跑出来则比较粗糙。1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入 SDS，而变性凝胶的有 SDS。 2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有 SDS，也没有巯基乙醇。 3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像 SDS-PAGE 电泳中蛋白质分离只与其分子量有关
9、。 4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像 SDS-PAGE 中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。 5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在 0-4 度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。八、分子量 还原 SDS-PAGE 测定 本法测得的分子量，除单链蛋白质外，均不是天然蛋白质的完整分子量，而是组成这些蛋白质的亚基或肽链的分子量。本法对一些电荷异常，或构象异
10、常，或带有大辅基的蛋白质不适用，如组蛋白 F1 和某些糖蛋白等。对一些结构蛋白如胶原蛋白等也不适用。准确度比较：点喷雾质谱法还原的 SDS-PAGE非还原的 SDS-PAGEHPLC此法测得的表观分子量由于翻译后修饰（磷酸化，糖基化），剪切，异构等原因，会比预期的分子量偏大。如：p53 蛋白，其表观分子量是 53kDa（这也是该蛋白名字的由来），但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是 43kDa。 九、N 末端氨基酸序列分析 重组蛋白经 N 末端氨基酸序列分析；必要时应用 SDS-PAGE, RP-HPLC 和质谱（MS）检测其真实性。 十、内毒素对活性的影响 内毒素（Endotoxin），是
11、革兰氏阴性菌细胞壁的产物。当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，表现毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂 A 成分。 内毒素与细胞膜上的受体结合引起免疫反应，对细胞有较强的毒性作用。我们的产品均采用多种方法有效去除内毒素,使用鲎试剂（Limulus Amebocyte,LAL）测定含量小于 0.1ng/ug (1 EU/ug)。 十一、贮存及复溶 产品均为无菌冻干粉剂，调整 PH 和盐浓度经 0.2um 过滤后分装冻干。 请使用手动化霜冰箱，由于每次冻融都会造成蛋白的部分变性，所以要适量分装尽量避免反复冻融。 干粉状态在室温下存放 3 周，不影响活性；放于-18以下，可稳定保存至少一年。 复
12、溶时依据说明书，大多数溶解在灭菌超纯水（18M.cm）中，浓度不低于 100g/ml，以待进一步稀释至工作浓度。蛋白质在高浓度下稳定，所以有些加入载体蛋白，但是可能会对实验造成影响。我们的产品均不含 carrier protein 或其他添加物（如 BSA、HAS、蔗糖等），而是以低盐的形式做冻干处理，微量的细胞因子在冻干过程中会沉积于管内，形成很薄或不可见的蛋白层。所以使用前先离心 20-30s，使附于管盖或管壁的蛋白集于管底，有些产品复溶需要加入醋酸，因为含 PBS 的冻干粉中性时容易吸附管壁，加入酸溶于液体中，表面活性剂也防止吸附。 复溶后的细胞因子，4可稳定储存 2 周；长期保存请分装
13、后存放于-20以下，可稳定保存至少三个月。最好在-80保存。分装时浓度要100ng/ul，体积要20ul。 十二、重组细胞因子的交叉活性大多数人类细胞因子对小鼠细胞都有活性。许多小鼠细胞因子对人类细胞也有活力表现，但是比相应人类细胞因子活力低。一些人类的细胞因子如 IL-7 在小鼠细胞中表现出比小鼠细胞因子更高的比活力。干扰素、GM-CSF、IL-3 和 IL-4 有物种特异性，对于非人类细胞几乎没有活性。成纤维细胞生长因子和神经营养因子是高度保守的，在其它的动物细胞中也能表现很好的活性。十三、细胞因子的应用免疫学实验细胞培养实验细胞治疗细胞调亡的研究干细胞培养与扩增分化（ips）细胞因子的功能性分析体外生化分析作为抗原，应用于生产高质量抗体抗体分析中作为阳性对照ELISA 和其他分析方法中作为标准品使用蛋白-蛋白相互作用
