第四章 中药制剂的含量测定.ppt

1、第四章 中药制剂的含量测定,第一节 含量测定的目的与意义,在我国药品质量标准中，鉴别、 检查和含量测定项目是判定中药制剂质量优劣的标准。中药制剂的鉴别是研究某种原料药或成分的存在与否，从而判定药物的真伪，而含量测定项目是研究某种成分的含量高低是否符合规定来判定药物的优劣。中药制剂的含量测定是质量控制中的一项重要指标。通过测定制剂中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣，以保证中药制剂的质量，达到临床用药安全、有效和中药制剂进入国际市场的需要。,第二节 含量测定样品的处理,中药制剂样品的基质和成分组成十分复杂，而且样品中被测成分往往含量较低，因此需要对

2、样品进行各种处理，使其符合所选定分析方法的要求。样品处理的主要作用有：将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确度。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。,第二节 含量测定样品的处理,一、样品的粉碎样品的粉碎有两个目的：是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度；是使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。 粉碎时注意事项：不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，因此可视实际情况

3、进行粉碎过筛。避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损或不干净等原因而玷污样品，防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎或碾磨，让其全部通过筛孔。,第二节 含量测定样品的处理,二、样品的提取 对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。 下面介绍几种常见的提取方法：冷浸法 回流提取法 连续回流提取法 超声提取法 超临界流体提取法,第二节 含量测定样品的处理,（一）冷浸法按所需准确度要求称取一定量样品置于带塞容器

4、内，摇匀后放置，浸泡提取，溶剂用量为样品重量的1050倍，并称重。浸泡时间1224小时，浸泡期间应注意经常振摇，浸泡后再称重，补足溶剂充分摇匀，浸泡后的溶液，可取部分测定，也可全部测定。部分测定法（即等量法）是将浸泡后的溶液，用适宜滤器过滤，精密量取一定量体积的滤液，与一定重量的样品相当，进行测定。此法不适宜挥发性较大的提取溶剂。全部测定法（即总量测定法）是将浸泡后的溶液滤过，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干得残留物用另一溶剂溶解，定量转入容量瓶，稀释至刻度，摇匀，进行测定。此法可克服部分测定法的缺陷，且提取时溶剂用量不必精密加入。,（一）冷浸法另外全部测定法中提取液的

5、浓缩蒸干，可根据具体情况采用下列方法：常压或减压蒸发，后者具有温度低、速度快，适于对热不稳定样品之优点；自然挥散或氮气流下吹干。适于小体积样品和挥发性溶剂，氮气流能防止氧化；冷冻干燥（常为水溶液），更适于热不稳定的样品。冷浸法的优点是操作简单，适于热不稳定的样品，且提取杂质少。其缺点是费时、费溶剂。,第二节 含量测定样品的处理,（二）回流提取法它是将冷浸法中的带塞容器换成回流装置，用单一溶剂或混合溶剂于水浴上加热回流提取，其余操作方法同冷浸法。 优点： 1、提取效率高于冷浸法；2、且可缩短提取时间，每次提取时间为 0.52小时，直至提取完全为止。 缺点：1、提取杂质较多；2、该法对热不稳定或具

6、有挥发性的成分 不宜使用。,第二节 含量测定样品的处理,第二节 含量测定样品的处理,（三）连续回流提取法样品置索氏提取器中，利用遇热可以挥发的溶剂进行反复提取（相当于总是在使用新鲜溶剂提取），一般提取数小时方可完全。 优点：1）无需过滤，提取完全后取下虹吸回流管，就可回收溶剂，再 用适宜溶剂溶解，定容， 进行测定。2）提取效率高，所需溶剂少，提取杂质少，操作简便。 缺点：受热易分解的成分不宜使用。,第二节 含量测定样品的处理,（四）超声提取法样品置适当的容器中，加入提取溶剂，放入超声振荡器中进行提取。一般样品30分钟内即可完成，最多不超过1小时。优点：超声提取能使样品粉末更好地分散于溶剂中提高

7、提取效率和提取速度。（超声的助溶作用）缺点：促使化学反应发生（如氧化还原反应、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。对于由浸膏制成的固体制剂，用上述方法提取时，通常是精密称取适量药粉于量瓶中，定量加适当溶剂提取后，以干燥滤纸过滤，弃去滤液，取续滤液（防止滤纸吸附或污染被测组分），按部分测定法测定。,第二节 含量测定样品的处理,（五）超临界流体提取法（Supercritical-fluid extraction, SFE）它是以超临界流体（常用CO2）作提取溶剂，有效、快速提取固体或半固体中的被测成分的样品预处理新技术。超临界流体（SF）是指高于临界压力（Pc）和临界温度（Tc）时所形成的单一相态

8、，它既不是液体，又不是气体，而具如下特性：对样品组分溶解能力强。超临界流体（SF）的密度与液体的相近（如CO2超临界流体的密度为0.30.9g/cm3），而其具有与液体相似的溶剂作用； 2) 有利于样品中的被测成分扩散进入SF中。SF的粘度与气体相近，比液体的略低2个数量级，扩散系数却比液体的高1个数量级以上，使其具有良好的传质性能；,3) SF能使提取效率和提取速度大大提高。SF的表面张力几乎为零，而较容易渗透进样品基质空隙中，有利于SF与样品的充分接触； 4) 同一种SF在不同温度和压力下可以提取极性或分子大小都不相同的化学成分。SF的密度、粘度和扩散系数等都与温度、压力和流体组成有关。温

9、度和压力稍高于临界点时，SF的压缩系数最大，压力的微小变化将导致较大的密度变化，而控制密度就可控制SF对溶质的溶解能力，目前也常用升压力（即升密度）提取法进行分步提取。 最常用的SF是CO2，它的性质稳定，使用安全，价格低廉，临界点低（Tc=31和Pc=7.4MPa），易于操作。,第二节 含量测定样品的处理,第二节 含量测定样品的处理,SFE具有优点：速度快萃取效率高、方法准确度高、选择性较高、节省溶剂、易于自动化，可避免使用易燃，有毒的有机溶剂，能与色谱和光谱等分析仪器直接联用的特点。SFE不仅常用于热不稳定成分或挥发性成分的萃取，而且也越来越多地用于热稳定性成分的萃取。 缺点：对设备要求高

10、。,第二节 含量测定样品的处理,三、样品的分离净化 （一）沉淀法 原理：它是基于某些试剂与被测成分或杂质生成沉淀，分离沉淀或保留溶液以得到精制的方法。 这种方法须注意：1）过量的试剂若干扰被测组分的测定，则应设法除去；2）大量杂质以沉淀形式除去时，被测成分应不因产生共沉淀而损失；3）被测组分生成沉淀时，其沉淀经分离后可重新溶解或直接用重量法测定。,第二节 含量测定样品的处理,（二）蒸馏法 原理：利用某些被测成分具有挥发性，可采用蒸馏法，收集馏出液进行含量测定，或某些成分经蒸馏分解生成挥发性成分，利用分解产物（要求结构明确）进行测定。目前以水蒸气蒸馏法应用较多。1）它可分为共水蒸馏法（即直接加热

11、法）、通水蒸汽蒸馏法和水上蒸馏法。如中药制剂中的挥发油，某些小分子生物碱（麻黄碱、於碱、槟榔碱）及丹皮酚等，都可用蒸馏法提取和分离净化。2）为了使挥发性成分更完全地蒸馏出来，有时也可用盐析作用，即在蒸馏液中加入一定量的无机盐，常用NaCl 、NaSO4、MgSO4等。,第二节 含量测定样品的处理,（三）液一液萃取法（LLE） 常用的两种LLE方法是有机溶剂直接萃取法和离子对萃取法。 直接萃取法原理：利用试样中被测成分与干扰成分在有机溶剂（萃取剂）中的溶解度不同，通过多次萃取来达到分离净化的目的。多次萃取虽然有利于提高萃取回收率和结果的准确度，但多次溶液转移等操作又会带来误差。有时对于组分复杂，

12、含量低的样品，由于样品数量多，多次萃取费时等原因，只要每次测得的回收率重现性好，常在可接受的回收率前提下可采用单次提取。直接萃取法常用的溶剂有氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯和乙醚等。可根据被测组分疏水性的相对强弱来选择极性适当的溶剂，既保证被测组成的充分萃取，又有很好的选择性。对于弱酸性成分应调节水相的pHKa-2。而弱碱性成分应调节水相的pHPKa+2（此处为其共轭酸的pKa），以使弱酸、弱碱性成分主要以非离子化的游离酸、或碱形式存在，而提高萃取率。在提取过程中也常利用中性盐的盐析作用，如水相用NaCl饱和，使被测组分进入有机相而提高提取率。,第二节 含量测定样品的处理, 离子对萃取法：其原理是在

13、适当的pH介质中，某些有机酸（碱）性物质形成的离子与带相反电荷的离子（也称离子对试剂）定量地结合成为弱极性的离子对，而易溶于有机溶剂，使之萃取分离。它最适合于高度电离的有机酸、碱化合物的萃取（不能用直接法萃取），在中药制剂分析中主要用于生物碱（B）的分析，其离子对试剂常为酸性染料（In-）如溴麝香草酚蓝（BTB）和溴甲酚绿（BCG）等，在水相中的定量反应为BH+（水相）+In_(水相) BH+In-（水相） BH+In-（有机相）形成的离子对BH+In-常用成氢键能力强的氯仿或二氯甲烷提取。由上反应可知要求水相中生物碱和酸性染料均有较高的离子化程度，因此必须注意水相的pH和离子对试剂的选择。通

14、常生物碱与BTB形成11的离子对，最好在pH5.26.4提取，而二元碱形成12离子对，最好在pH3.05.8提取（二元碱的碱性弱，需要在较低的pH下离子化后形成离子对）。若氯仿层中的微量水份引起浑浊，可通过加入少许乙醇或久置分层变得澄清，也可分离有机相后加入脱水剂（常用无水Na2SO4）或经滤纸滤过除去微量水份，另外液一液萃取时应尽量避免发生乳化现象。,第二节 含量测定样品的处理,（四）色谱法 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液固萃取（LSE）具有设备简单，使用方便，快速，净化

15、效率较高而最常用，将在此做一简介。LSE通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长515cm，内径0.51cm的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，也可将色谱柱流出的样品进一步用GC、HPLC、TCL分离后测定。LSE的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8、C18、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。,固相萃取操作一般有四步： 活化-除去柱子内的

16、杂质并创造一定的溶剂环境。 上样-将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。 淋洗-除去不需要的组分。 洗脱-用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集。,第二节 含量测定样品的处理,硅胶、氧化铝等：它们是传统的吸附剂，多以0.070.15mm(200100目)的颗粒15g用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂的样品加到柱上时非极性或低极性的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测定。例如用法（吸收系数法）硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。

17、若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，则可以将杂质和被测成分分离。另外，硅胶也和下面所述的硅藻土等一样，还可作亲水型填料使用，常见的商品硅胶柱为Sep-pak Silica，通常以甲醇、水处理后上样。,键合相硅胶：十八烷基键合相硅胶（简称C18或ODS）是常用的固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药物。该类LSE的一般操作程序为： 1)柱的活化。用2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.5毫升水洗去柱中的甲醇。 2)上样。 3)清洗。用25ml的水清洗以除去弱保留的亲水成分，如无机盐、氨基酸

18、、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、低肽等。 4)洗脱。用25ml甲醇或甲醇-水洗脱大分子的肽、甾体、较亲脂的药物等强保留的待测组分。,第二节 含量测定样品的处理,大孔树脂：它可分为极性和非极性型极性 丙烯酰胺聚合物;非极性 苯乙烯和二乙烯苯的共聚物.其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂中的黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用30%乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂的主要特点是表面积极大，传质速率较高和具有不同的极性及适于吸附较大分子。 树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该

19、填料用量常为12g，有时 也用100150mg来萃取血、尿中药物，操作程序类似ODS填料。,第二节 含量测定样品的处理,第二节 含量测定样品的处理,聚酰胺：它是常用的有机吸附剂，主要通过与溶质形成氢键而产生吸附作用。常用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离，如测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上柱，水洗去部分杂质，以95%乙醇洗脱总黄酮后测定。,第二节 含量测定样品的处理,硅藻土、纤维素：它们为常用的亲水型填料，其原理为分配作用。填料作为支持剂，多以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相，较亲脂的成分从固定相转移到流动相，而被洗脱，达到萃取的目的。其萃取率较高（一般大于80%），无浓集作

20、用，萃取液较纯净，但洗脱剂用量较大（一般大于5ml）硅藻土柱则用干柱直接上样，柱可再生。常见牌号为Extretut。纤维素柱的使用与硅藻土柱相似。,离子交换树脂：憎水基质的离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中溶解度不大的药物、洗脱剂中需含一定量的有机溶剂。离子交换树脂柱可用于除去样品中的离子，防止组分分解，更常用于萃取样品液中可离解化合物。,第二节 含量测定样品的处理,第二节 含量测定样品的处理,此外，近年来发展起来的固相微萃取(Solid-Phase microextraction, SPME)和液相微萃取(Liquid- Phase microextraction

21、,LPME)技术有良好的应用前景。SPME是一种无溶剂的萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。,（五）消化法对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消化方法。（1）硝酸高氯酸法 该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。 （2）硝酸硫酸法 该法适用于大多数有机物质的破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐的金

22、属离子的测定，不宜采有此法。,第二节 含量测定样品的处理,第二节 含量测定样品的处理,（3）硫酸硫酸盐法 本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏加速完全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分解为SO3而损失。经本法破坏所得金属离子，多为低价态。本法常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。 湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实验校正。操作时应在通风橱内进行。,第二节 含量测定样品的处理,干法消化 本法是将有

23、机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3或轻质MgO等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。 应用本法时要注意以下几个问题：1）加热灼烧时，控制温度在420以下，以免某些被测金属化合物的挥发。2）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶

24、解，但此时切勿弃去。,第三节 常用定量分析方法,分类重量分析和滴定分析。化学分析法所用仪器简单，结果准确。主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。,第三节 常用定量分析方法,（一）重量分析法重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。1、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：供试品的干燥失重测定；水分测定均属挥发法；中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。2、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的

25、目的。如冰硼散中冰片的含量测定；地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取法。3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；复方元胡注射液总碱的测定。,第三节 常用定量分析方法,（二）滴定分析法滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。1、酸碱滴定法适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。直接滴定：对于KC10-8的酸、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物

26、碱的含量测定、颠茄酊中生物碱的含量测定。间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的含量测定、草乌注射液中生物碱的含量测定等。 2、沉淀滴定法主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有机成分的含量测定。,第三节 常用定量分析方法,3、配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等矿物类制剂的含量。如万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；牛黄解毒片中石膏的含量测定。 4、氧化还原滴定法适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、糖类及矿物药Fe、As等成分的中药制剂。如磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；牛黄解毒

27、片中雄黄的含量测定；丹皮酚注射液中丹皮酚的含量测。,第三节 常用定量分析方法,二、可见一紫外分光光度法该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法,具有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。该法要求被测成分本身或其显色产物对可见紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。,紫外分光光度计工作原理,紫外吸收光谱图,第三节 常用定量分析方法,（一）单波长光谱法,第三节 常用定量分析方法,（二）多波长光谱法（计算分光光度法） 供试品溶液中若有多种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定多种波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用适当的数学处理方

28、式进行多组分的同时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中的某个组分。这就属于多波长光谱法的范畴。,第三节 常用定量分析方法,测定步骤UV光谱测定：它是指分别测定被测组分和干扰组分溶液的UV光谱于同一坐标系中（即重迭扫描）。被测组分的光谱通常用纯化学对照品配制成适当浓度的溶液进行测定。对于干扰组分化学结构已知者，也可用纯化学对照品测定其UV光谱，而对于干扰成分的组成尚不清楚者，通常用阴性样品代替干扰成分来测定UV光谱。阴性样品分为缺含被测成分药材（即缺味）阴性样品和缺被测成分阴性样品。波长选择：它是指根据各种测定方法的原理选择一组合适的波长。使得既能消除共存组分的干扰，又能使被测组分的测定灵敏

29、度高（即回归直线方程的斜率大）和测定误差小。,2测定步骤标准曲线绘制：通常按样品测定条件，用标准品配制57种不同浓度的溶液（必要时可加入干扰组分），分别测定各所选波长处的吸收度，然后计算其回归直线方程（要求其相关系数r 0.999）。样品测定：配制被测组分浓度处于标准曲线线性范围内的样品溶液（平行35份），测定各所选波长处的吸光度。按回归直线方程和稀释度计算样品中被测组分的浓度或含量。,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,计算分光光度法的特点：在测定组成已知的复杂样品时，可省去或简化样品预处理步骤；中药制剂分析中，干扰组分或阴性空白样品的变动性大，使得其方法的适应性差，而只适应

30、于同样品或内控应用；当测定的吸收度处在吸收曲线的陡峭部位时，波长的微小变动可能对测定结果造成显著的偶然误差；在实际工作中，由于测试条件的变化及仪器与性能的限制，多波长法常用标准曲线法进行样品的测定。,第三节 常用定量分析方法,三、薄层扫描法薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录方法，又称薄层色谱扫描法（TLCS），相应仪器称为薄层扫描仪（Thin Layer Chromatogram Scanner）。薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品

31、的鉴别、杂质检查或含量测定。,第三节 常用定量分析方法,（一）基本原理薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定A-l(吸光度-波长曲线)或F-l曲线(在固定发射波长下的荧光强度F随展开距离L的变化所测定的F-L曲线) 。根据薄层扫描的测定方式分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法二种方法。,三、仪器及其工作原理1.薄层扫描仪 中国药典采用双波长薄层扫描仪。常用的有岛津CS-930型和CAMAG-型等。 2.扫描仪工作原理,第三节 常用定量分析方法,1、薄层吸收扫描法基本原理：Kubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸

32、光度的关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点的相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即Kubelka-Munk曲线。光源：钨灯和氘灯；灵敏度：在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达ng级；适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。,2、薄层荧光扫描法基本原理：F=2.3KI。ECL或F=KC光源：氙灯或汞灯。灵敏度：最低可测到10-50pg(1pg=10

33、-12g )。适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中F与C 进行运算。,第三节 常用定量分析方法,（二）薄层色谱的规范化操作1、仪器与材料薄层板；涂布器；点样器材；展开箱（层析缸）显色与检测仪器2、操作方法 薄层板的制备；点样；展开；检测；,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,（三）定量分析方法1、方法学考察新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作曲

34、线、定量结果的精密度及准确度、统计检验等内容。,（1）工作曲线检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工作曲线被校直为直线，否则，调整SX值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二点法定量。确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,（2）精密度考察取

35、同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点5点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（RSD），作为衡量定量分析结果精密度的指标。RSD应小于4%。式中：为n次测量的平均值，S为标准差。,第三节 常用定量分析方法,（3）准确度考察回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加样回收率（R）来衡量，其值应在95-105%之间，测量数据一般为5-6个。将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，计算回收率（R）。,（4）统计检验统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系

36、统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。统计检验包括F检验与t检验。F检验即精密度差别检验，用以检验两组数据的精密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。t检验即准确度差别检验，用以检验两组测量数据的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t检验证明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法可以代替旧方法，t检验一般为双侧检验。t检验与F检验的具体方法参见分析化学的有关论著，此从略。,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,2、定量方法常用的定量方法有外标法、内标法、追加法（叠加法）及回归曲线定量法。 （1）外标法外标法是薄层色谱扫描最常

37、用的定量方法，方法简便，但点样必须准确。 外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为： C=F1A式中：C为组分的重量或浓度，A为测得该组分的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数。,外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点样量），才能决定一直线,其计算公式为： C=F1A+F2式中：C、A同前，F1为直线的斜率或比例常数，F2为纵坐标的截距，F1和F2值由仪器自动算出。外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比定量，为减小误

38、差，同一薄板上供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个；并调整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积相接近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样。,第三节 常用定量分析方法,外标一点法的直线方程： C = F A F 为斜率 外标两点法的直线方程：,、,F1为斜率,F2为截距,第三节 常用定量分析方法,（2）内标法内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。内标物的选择要求是：纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。内标物须为样品中所不含有的成分。内标物不与其它斑

39、点相重叠，分离度合乎要求。为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中的浓度应相等。,特点：1）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。2）不易找到适宜Rf值的纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦。 方法：1）内标一点法：当工作曲线通过原点时采用内标一点法。 内标一点法公式： 2）工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法 内标二点法公式：式中：C、Cis分别为组分及内标物的浓度或重量，A、Ais分别为测得组分及内标物的峰面积，F1为直线的斜率或比例常数，F2为截距，F1和F2由仪器自动计算并内存，可直接给出样品的浓度或重量。,第三节 常用定量分析方法,（3）回归曲线定量法将不同浓度（或不同

40、量）的标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描;由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行线性或非线性回归;直接由回归方程或回归曲线计算供试液含量的方法;CAMAG系列薄层扫描仪即采用此方法。,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,（四）影响薄层色谱分析的主要因素1、样品的预处理及供试液的制备2、薄层色谱的点样技术3、吸附剂的活性与相对湿度的影响4、溶剂蒸气在薄层色谱中的作用5、温度的影响,控制相对湿度用的硫酸溶液,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,四、气相色谱法气相色谱法是以气体为流动相的柱色谱分离分析方法。特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，样品用量少

41、及分析速度快等特点，兼具分离、分析的功能，适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性组分的分析。适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性组分的分析。,第三节 常用定量分析方法,（一）基本原理气相色谱是根据汽化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间作用不同，在色谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转换成电信号变化记录成色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析的方法。,1、塔板理论将色谱柱的柱效用理论塔板数n或理论塔板高度H衡量，取决于区域宽度（、W1/2、W），其计算公式为,第三节 常用定量分析方法,

42、n=,=5.54,=16,H=L/n,适中：tR为组分的保留时间，、W1/2、W分别为组分的标准差、半峰宽和基线宽度。,若以调整保留时间tR代替tR，则得到反映色谱柱实际柱效的有效理论塔板数neff。,neff=,=5.54,=16,Heff=L/neff,可见，当tR一定时，峰越窄，则H越小，n越大，柱效越高，分离性能越好。,第三节 常用定量分析方法,2、速率理论速率理论研究了色谱过程中各种动力学因素对柱效（峰展宽）的影响，提出了Van Deemeter方程式： H=A + B/u + CuA、B/u、Cu分别为涡流扩散项、分子扩散（纵向扩散）项、传质阻抗项，从而解释了板高随载气流速而改变，

43、且有最佳流速（Hmin）的现象。速率方程式对于色谱分离条件的选择具有指导意义，它可以说明色谱柱的填充均匀程度、载体粒度、载气种类、柱温和固定液膜厚度对柱效、峰扩张的影响。对于开口毛细管柱色谱，涡流扩散项A=0，故Van Deemeter方程式可简化为H=B/u+Cu，其传质阻抗小，柱长又远远大于填充柱，所以毛细管柱的柱效要比填充柱高得多，其理论塔板数达105-106。,第三节 常用定量分析方法,3、分离度的计算分离度是衡量分离效果的指标，以相邻两色谱峰峰尖距对峰宽均值的倍数表示，其定义式为：,两峰基本分离，R1.5两峰完全分离。分离度的影响因素很多，可用基本分离方程式概括如下：,a、b、c分别

44、为柱效项，柱选择性项和柱容量项。,R=,=,R=,a b c,第三节 常用定量分析方法,4、系统适用性试验 按药典标准，中药制剂分析时，需按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，既用规定的对照品对仪器进行试验和调整，以达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。（1）色谱柱的理论板数n 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR和半峰宽Wh/2，按计算色谱柱的理论板数。若测得理论板数低于各品种项 下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、柱填充等），使理论板数达到要

45、求。（2）分离度R 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其它峰或内标峰之间有较好的分离度，一般R1.5。,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,（3）重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%，也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对平均偏差也应不大于2.0%。（4）拖尾因子T 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子T是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误

46、差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：,T=,式中，W0.05h为0.05峰高处的峰宽，d1为峰极大至峰前沿之间的距离，除另有规定外，T应在0.95-1.05之间。,第三节 常用定量分析方法,（二）实验条件的选择在气相色谱分析中，为达到满意的分离效果，需依据Van Deemeter方程式和分离度方程式选择合适的分离条件，主要有固定相、柱温、载气流速等条件的选择。1、固定相的选择1）气液色谱固定液：按极性相似、化学官能团相似的相似性原则和主要差别选择。载体：一般为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理的硅藻土。2）气固色谱：固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分离水及含羟基（醇）化合物。,第三节 常

47、用定量分析方法,2、柱温的选择选择的基本原则：在使最难分离的组分有符合要求的分离度的前提下，尽可能采用较低柱温，但以保留时间适宜及不拖尾为度。在实际工作中一般根据样品的沸点来选择柱温，具体有如下几点：高沸点的样品（沸点300-400），采用1-5%低固定液配比，柱温200-250。沸点为200-300的样品，采用5-10%固定液配比，柱温150-180。沸点为100-200的样品，采用10-15%固定液配比，柱温选各组分的平均沸点2/3左右。气体等低沸点样品，采用15-25%高固定液配比，柱温选沸点左右，在室温或50下进行分析。对于宽沸程样品，需采用程序升温方法进行分析。但需注意的是柱温要低于

48、固定液的最高使用温度。,3、载气的选择主要从对峰展宽（柱效）、柱压降和检测器灵敏度的影响三方面考虑。N2是最常用的载气；载气流速较低时，宜用N2；流速高时，宜用H2、He；较长色谱柱，宜用H2作载气；热导检测器应选用H2、He；氢焰检测器、电子捕获检测器，一般用N2；一般控制载气流速高于其最佳流速。常用的载气流速为20-80ml/min。,第三节 常用定量分析方法,第三节 常用定量分析方法,4、其他条件的选择气化室（进样口）温度：气化温度取决于样品的挥发性、沸点范围、稳定性及进样量等因素。 检测室温度 检测器温度一般需高于柱温，以免色谱柱的流出物在检测器中冷凝而污染检测器。通常可高于柱温30左

49、右或等于气化室温度。进样量 在检测器灵敏度足够的前提下，尽量减少进样量，通常以塔板数下降10%作为最大允许进样量。对于填充柱，气体样品为0.1-1l，液体样品为0.1-1l，最大不超过4l为宜。毛细管柱需用分流器分流进样，分流后的进样量为填充柱的1/10-1/100。此外，进样速度要快，进样时间要短，注意留针时间和室温的影响，以准确控制进样量，以利于分离。,第三节 常用定量分析方法,5、检测器热导检测器（TCD）：通用型检测器，应用广泛，但灵敏度较低；氢焰离子化检测器（FID）：应用最广泛，适用于含碳有机物的测定，载气多为N2。氮-磷检测器（NPD）：专属性检测器，可用于中药及其制剂中农药残留量的检测。电子捕获检测器（ECD）：专属性检测器，适用于痕量电负性有机物如含卤素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。,第三节 常用定量分析方法,（三）定量分析方法气相色谱常用的定量方法有内标法、外标法、归一化法等。 1、内标法特点：为最常用的定量方法优点：可抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因所带来的定量分析误差；缺点：样品的配制较麻烦，有些内标物不易寻找。关键：选择合适的内标物。适用范围： 适用于样品的所有组分不能全部流出色谱柱；检测器不能对每个组分都产生信号；只需测定样品中某几个组分含量时的情况。,