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第十章 细胞增生和凋亡的分子机制-1.doc

上传人:hskm5268 文档编号:5818598 上传时间:2019-03-18 格式:DOC 页数:9 大小:121.50KB
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资源描述

1、第十章 细胞增生和凋亡的分子机制多细胞生物体细胞命运 细胞周期增生 分化成具有特定功能的细胞 死亡并从生物体中消失 体内自发的细胞死亡是细胞凋亡第一节 生长因子信号转导活化细胞周期进程是细胞增生的分子机制 细胞周期 参与细胞周期的蛋白质 调控蛋白协同作用调控细胞周期 生长因子通过信号转导调控细胞周期细胞周期:大多数真核细胞经过一系列有序事件,使细胞体积增大,染色体复制,并且分裂成两个各含有一套完整的染色体的子代细胞细胞周期: 四个周期间期(G1 期 S 期 G2 期 M 期):蛋白质合成旺盛,DNA 复制 2nG1 细胞 4n 的 G2 期细胞细胞体积增大M 期 细胞分裂 4n 的细胞分裂为两

2、个 2n 的 G1 期细胞细胞周期中的四个关卡1.G1 晚期的限制点 2.G1-S 转折的 DNA 损伤关卡 3.G2-M 转折的 DNA 损伤关卡 4.M 期的有丝分裂中期关卡或称纺锤体组装关卡关卡是调控细胞周期的位点 为保持细胞周期正常进行,细胞周期中存在四个关卡:G1 晚期的限制点;G1-S 转折和 G2-M 转折的 DNA 损伤关卡;M 期的有丝分裂中期关卡或称纺锤体组装关卡二、有许多蛋白质参与调控细胞周期进程周期蛋白(CYCLIN ) 周期蛋白依赖性激酶( CYCLIN DEPENDENT KINASES(cdk)周期蛋白周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI) RB 及 E2FDP1

3、转录因子调节 Cdk 磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶 泛酸(ubiquitin)和使蛋白质泛酸化(ubiquitination) 的酶(一)周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶复合物驱动细胞周期进程周期蛋白-含量随着不同细胞周期时期升高和降低的蛋白质,可分为 A、B 、C 、D、E 等周期蛋白的含量受以下几方面的调控:生长因子诱导的基因表达 泛素介导的蛋白质降解 在细胞核与细胞质间的运输(周期蛋白 B)周期蛋白的结构有结构保守的 100 多个氨基酸残基的周期蛋白盒,是与 Cdk 结合的部位周期蛋白与相应的 Cdk 结合成异二聚体周期蛋白依赖性激酶(Cdk)组成型表达的核内丝苏氨酸蛋白激酶 单独存在

4、的 Cdk 无活性与相应的周期蛋白结合后变构形成异二聚体,并被磷酸化和去磷酸化调控才能在有活性和无活性状态之间转换。周期蛋白是调节亚基,Cdk 是催化亚基有活性的 Cdk 能磷酸化底物蛋白质如 Rb 蛋白,转录因子、组蛋白等,调控它们的活性,驱动细胞周期进程 Cdk 复合物的活性受 CKI 抑制The main human cyclins and CdksCylin Cdk FunctionD1,D2,D3 Cdk4,Cdk6 G1 progressionE, A Cdk2G1-S transition,S-progressionB, A Cdk1 G2-M transition成熟促进因子(

5、mature-promoting factor, MPF)周期蛋白 B 和 Cdk1(Cdc2)的复合物Cdc2 is the protein that encoded by genes which are required for passage through START as well as for entry into mitosis.Cyclin B is a regulatory subunit required for catalytic activity of the Cdc2 protein kinase.(二) CKI 抑制 Cdk 及周期蛋白 Cdk 复合物的活性CDK

6、抑制物(CKI)的种类(两类)1. Cdk4 和 Cdk6 抑制因子家族,包括 P15、P16、P18 和 P19 蛋白 特异地识别和结合 Cdk4 或 Cdk6,抑制周期蛋白 D 与 Cdk4 或 Cdk6 地结合与周期蛋白 DCdk4/6 结合,抑制 Cdk4/6 利用 ATP 磷酸化底物2. Cip/Kip(细胞因子诱导地蛋白/激酶相互作用蛋白)家族,包括 P21、P27 和 P57是细胞接受到接触抑制、DNA 损伤、低氧及某些细胞因子等信号后的产物和周期蛋白Cdk 复合物结合,抑制它们的活性对周期蛋白 DCdk4/6 有正调节作用(三)Rb 蛋白与转录因子 E2FDP1 的结合对 G1

7、 期进展产生负调节作用RB 家族的成员 RB(P105 RB,视网膜母细胞瘤蛋白)及 P107 和 P130 分子中有一个口袋状结构,称口袋蛋白RB 家族的分子中口袋蛋白能与多种蛋白结合,如转录因子 E2FDP1 复合物、RNA 聚合酶等,并调控它们的活性G1 早期低磷酸化的 RB 与 E2FDP1 复合物结合,抑制它的转录因子功能G1 中期及晚期,周期蛋白 DCdk4/6 和 E/Cdk2 先后磷酸化 RB,磷酸化的 RB 失去活性,释放出 E2FDP1游离的 E2FDP1 活化靶基因转录核苷酸及 DNA 合成酶的基因,如四氢叶酸还原酶,胸苷激酶,DNA 合成酶 的基因周期蛋白 D、E、A

8、及 Cdk2 基因 某些细胞癌基因游离的 E2FDP1 活化靶基因转录E2F 基因本身E2F 活化自身基因及周期蛋白 E,加速 RB 蛋白在 G1 晚期磷酸化及释放 E2FDP1E2F 靶基因的表达使细胞完成 DNA 复制的准备,细胞通过限制点(四) 使 Cdk 磷酸化和去磷酸化的酶也调节 Cdk 活性Cdk1 101 位苏氨酸被 Cdk 活化激酶磷酸化,可将活化15 位酪氨酸及 14 位苏氨酸磷酸化,失去活性 G2 期,三个部位都磷酸化,无活性15 位酪氨酸及 14 位苏氨酸去磷酸化后,才能有活性( 五) 泛素蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用泛素(Ub)是由 76 个氨基酸残基组

9、成的多肽,高度保守,广泛存在于所有真核细胞内Ub 利用其末端甘氨酸末端残基与靶蛋白的 或 氨基结合,使蛋白质泛素化标记,以便于进一步降解Ub 与靶细胞的结合由一系列酶连续催化完成 泛素活化酶(E1)泛素偶联酶( E2)泛素蛋白连接酶( E3)蛋白质泛素化过程所需要的酶:泛素活化酶 E1 和泛素偶联酶 E2 都是巯基酶,参与酶催化反应泛素蛋白连接酶 E3 是多亚基酶,有两类: SCF 复合物 APC(有丝分裂后期促进复合物)SCF 复合物三个核心成分(Skp1、Cdc53/Cullin 和 Fbox)底物先被磷酸化,才能和 Fbox 蛋白结合Cdc53/Cullin 和另一亚基 Rbox 蛋白结

10、合泛素化的 E2,并催化泛素和底物连接SCF 复合物的底物有周期蛋白 D、E 、P21、P27、E2F 和 WeelAPCAPC 由 10 种以上的亚基组成,能与 E2 结合的泛素转移给周期蛋白 A 和 B。有功能的纺锤体形成后,APC 也能多泛素化连接姐妹染色体的蛋白通过多泛素化途径降解的蛋白质都是一些短命的蛋白质,如周期蛋白,P21,P27,E2F,Weel等与周期蛋白泛素化有关的序列 周期蛋白 A 和 B 的 N 端 9 个氨基酸残基组成的保守序列,称破坏蛋白盒 周期蛋白 D 和 E 的 C 端保守的 PEST(脯谷丝苏)序列过程1.E1 利用 ATP 水解释放能量活化 Ub,使半胱氨酸

11、残基与 Ub 的 C 末端甘氨酸残基间形成高能硫酯键2.E1 将活化的 Ub 传递给 E2,形成 UbE2 中间体 E2 是一类小分子量蛋白质,含有一个保守的核心结构域,其中的半胱氨酸与 Ub 也以高能硫酯键相连3.在 E3 的催化下, Ub 的 C 末端与靶蛋白的赖氨酸残基的 氨基以一个酰氨异构肽键连接,形成泛素化蛋白质4.泛素化蛋白 Ub 分子上的 48 位赖氨酸残基的 氨基进一步不断泛素化,形成泛素化蛋白质三、调控蛋白协同作用调控细胞周期(一) Cdk4/6 和 Cdk2 的活化是限制点处调控的关键因素 细胞周期蛋白 D 最早出现于 G1 中期,在晚期达到高峰 细胞周期蛋白 E 最早出现

12、于 G1 晚期,在 G1-S 转折处含量最高 周期蛋白 D 和 E 分别与 Cdk4/6 和 Cdk2 形成复合物,使 Rb 磷酸化释放转录因子,使靶基因转录,作好复制准备 周期蛋白 D 和 E 经 SCF 泛素化而降解(二)Cdk1 活化是 G2M 关卡处关键调控因素 周期蛋白 B-Cdk 活化 周期蛋白 B 磷酸化使周期蛋白 B-Cdk1 在核内聚集,并磷酸化底物蛋白,使染色体致密化,核膜解体,纺催体形成(三)APC 介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开 M 期进入 G1 期的关键调控因素 周期蛋白 A/B-Cdk1 是 APC 磷酸化而活化的因素之一 有丝分裂中期介导姐妹染色体稳定地附着在纺

13、锤体的有蛋白激酶和蛋白质因子 APC 活化导致连接姐妹染色体地蛋白质降解,细胞通过有丝分裂中期关卡,可进展到 G1 期(四) DNA 损伤关卡与 G1 及 G2 期停滞相关 G2 期地停滞涉及一系列的磷酸化过程(四)生长因子等细胞外因素通过信号转导调控细胞周期 细胞退出细胞周期,从 G1 期进入 G0 期,可由以下因素引起 环境中的信号分子促进 G1 期细胞退出细胞周期,并开始分化 环境中启动细胞分裂的生长因子不足 体外培养的原代细胞在分裂一定次数后进入衰老状态,不能回到 G1 期的终末 G0期。G0 期的细胞仍然进行着新陈代谢,许多具有特定功能的 G0 期细胞甚至不停地合成及分泌蛋白质,如胰

14、腺细胞、肝细胞G0 期重返 G1 期要经过三个阶段获得资格 进入 需要血小板源生长因子 表皮生长因子和胰岛素进展 需要胰岛素样生长因子 1 最终活化周期蛋白Cdk 复合物,从而使细胞从 G0 期进入 G1 期G1 期的细胞也需要生长因子促进细胞周期的进程生长因子 受体酪氨酸蛋白激酶及整合素 Ras-Raf-MAPKK-MAPK/ERK 途径 周期蛋白 D 的表达 进入胞质被降解 (G1 早,中期)生长因子 活化 p21 和 p27 促进周期蛋白 D 和 cdk4/6 结合 使少量 RB 磷酸化 E2FDP1 促进周期蛋白 E 和 Cdk2 的表达第二节 细胞凋亡是一种自发的程序化细胞死亡 早在

15、 1972 年 Kerr 等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析,细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死 ( Necrosis) ,另一种是新提出的程序性细胞死亡 ( Programmed cell death, PCD) 学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮,进展极快,现在普遍称之为细胞凋亡(Apoptosis) 细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程 是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)PCD 最初是 1956 年发育

16、生物学中提出的概念,是个功能性概念,强调的是其分子生物学和生理功能,一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的,并受到严格程序控制的正常组成部分。形态学特征 凋亡的起始:细胞器、染色质等开始变化 凋亡小体的形成:质膜包裹染色质和细胞器 凋亡小体的消化:被吞噬细胞消化生物化学特征 胞浆内 Ca2+浓度升高。 细胞内活性氧增多。 质膜通透性变大。 DNA 内切酶活性被激活升高,双链 DNA 在核小体之间切断形成 180200bp 为基数的有序片段。 型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶(Calpain)活性升高。细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长 维持内环境稳定

17、发挥积极的防御功能细胞凋亡是正常的生理过程,但是凋亡可能会引起疾病发生。因此,近年来对于细胞凋亡的研究,已成为自然科学界的关注热点。凋亡途径是由诱导产生的胱天蛋白酶级联反应 凋亡途径最早在线虫中阐明凋亡途径涉及四个 ced 基因产物:Ced4 蛋白是一种蛋白酶,能活化 Ced 3 蛋白Ced3 蛋白是一种蛋白酶,能使许多底物蛋白降解,从而出现凋亡形态学变化Ced9 蛋白,能使 Ced4 蛋白失活 线虫胚胎期 Ced 9 基因突变失活能使许多本应存活的细胞由于 Ced4 和 Ced3 的活化而凋亡,结果胚胎死亡。Egl-1 的产物能抑制 Ced9,过量表达可诱导凋亡 胱天蛋白酶的名称来自该酶的活

18、性中心有催化作用的半胱氨酸残基,能水解底物蛋白中特异部位的天冬氨酸残基羧基侧肽键 凋亡蛋白酶活化因子 1(Apaf1)是一种构架蛋白,能活化胱天蛋白酶 Bcl2 家族中有些成员是抗凋亡的,另一些成员是促凋亡哺乳动物中 Caspase 家族成员有相似的结构与活化过程有 14 种 家族成员以酶前体的形式合成 前体的结构分三部分:N 端的原域,中间的 p20 和 C 端的 p10 域。 域与域之间有可以被胱天蛋白酶水解的位点在活化过程中,前体被水解成 3 个域,原域丢失,2 个 p20 域和 2 个 p10 域组装成含有两个活性中心的四聚体成熟酶胱天蛋白酶分类 1.起始者胱天蛋白酶,如 caspas

19、e 8,9 和 10 位于上游,有较长的原域, 和接头蛋白或构架蛋白相互作用的功能域 通过蛋白质蛋白质相互作用自我激活 Caspase 8 前体位于途径上游,在接头蛋白 FADD 的介导下从胞浆中被募集到细胞膜,提高内在的酶活性而自我激活 Caspase 9 前体也位于途径上游,能与 Apaf 1 等蛋白质结合而自我激活2.效应者胱天蛋白酶,如 caspase 3,6 和 7 有较短的原域,位于胱天蛋白酶级联下游 前体能被起始者胱天蛋白酶切割而活化 活化的效应者胱天蛋白酶能切割底物,使细胞凋亡哺乳动物的 Bcl2 家族是凋亡调节蛋白Bcl-2 家族: (B cell lymphoma/leuk

20、emia-2)B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2)Bc1-2 是一种原癌基因 是 ced-9 和 Egl1 在哺乳类中的同源物 和一般的癌基因不同,Bc1-2 家族中有些成员是抗凋亡的,另一些是促凋亡的。 Bcl-2 家族已发现 15 个成员,所有 Bcl-2 家族成员均含有 1 个或多个 BH 结构域。 蛋白含有 4 个 Bcl-2 同源结构域,依次命 名为 BHl、 BH2、BH3 和 BH4 作用机制:影响凋亡蛋白酶活化因子 1(Apaf1)的功能 影响线粒体的结构与功能 可分为 3 个亚族: Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1 Bcl-2 亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用

21、分子含有 BH1BH4 区,大多数成员 C 端有能插入线粒体外膜和内质网膜的疏水肽段,分子面向胞浆Bax 亚家族 Bax、Bak、Bok 它们的作用与 Bcl-2 亚家族的作用相反,促进细胞凋亡 除缺少 BH4 区外,结构和分布与第一类成员相识 促凋亡成员位于途径的下游BH3 亚家族 Bik、Blk 、 Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid 仅有 BH3 结构域 它们的作用也与 Bcl-2 亚家族的作用相反,可促进细胞凋亡。 促凋亡的基因位于途径的上游。死亡受体途径及线粒体途径是两种主要的凋亡信号转导途径外源性死亡受体途径的关键步骤是死亡诱导信号复合物的形成 被胞外信号所诱导的细胞凋亡

22、途径称外源性凋亡途径 有八种死亡受体,属于肿瘤坏死因子受体(TNFreceptor)家族成员Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、 DcR1、DcR2TNF receptor 的结构特征 I 型跨膜糖蛋白 胞膜外富含半胱氨酸的结构域(cysteine-rich domain CRD) 胞内有死亡域(DD) 以三聚体形式存在,与三聚体的 TNF 结合死亡结构域蛋白 死亡结构域蛋白(death domain protein DD)包括 TRADD,FADD ,RIP 等。这些蛋白质 C 端都有一段同源的死亡结构域,通过这些死亡结构域与死亡受体的胞浆区相作同,传递死亡受体所引起的各

23、种信号. TRADD:TNF receptor-associated death domain protein 34kd,与 TNFR1 胞浆区相关的蛋白质,传递 TNFR1 的大部分信号FADD:Fas-associated death domain protein 与 Fas 胞浆区相关的蛋白质。N 端序列为死亡效应区域(death effector domain DED),也是接头结构域,具有 DED 结构的蛋白质之间可以相互结合起来。RIP:receptor-interaction protein 74kd,直接与 Fas 结合,还可以通过 TRADD间接与 TNFR1 结合。RIP

24、除了含有 C 端 DD 外,还含有 N 端的蛋白激酶同源区(protein kinase homolog PKH),具有蛋白丝/苏氨酸激酶活性 TRAF(TNF receptor-associated factor):一组与 TNFR 家族成员胞浆区关联的接头蛋白TRAF 结构域:分为 TRAF-N 和 TRAF-C,TRAF-C 同源性高,是 TRAF 蛋白与 TNFR超家族成员胞浆区结合的部位。锌指结构:经典的锌指结构 C2H2环指结构:参与信号转导途径,截去则发挥相反作用,成为信号转导抑制蛋白Fas 受体途径 配体为 FasL,也是一种细胞表面的单跨膜蛋白质,分布在细胞毒性 T 细胞表面

25、 FasL 在细胞表面形成三聚体 细胞毒性 T 细胞识别靶细胞后, T 细胞表面的三聚体 FasL 与 Fas 结合,使 Fas 也形成三聚体 三聚体 Fas 的胞内段被激活,DD 通过与接头蛋白 FADD 中的 DD 相互作用而募集FADD 构成死亡诱导信号复合物(DISC) FADD 中的死亡效应域(DED ) ,能与 caspase 8 前体原域中的 DED 作用而募集caspase 8 前体 募集 caspase 8 前体自我激活,并且活化下游的 caspase 3,导致病毒感染细胞凋亡细胞凋亡的膜受体通路 FASL+FAS +FADD 凋亡诱导复合物(DISC) 胞质中游离的 cas

26、pase8 聚集到这个复合物上 细胞有足够 caspase8 细胞 caspase8 浓度不够 死亡受体活化, 切割 Bid tBid 从胞质到线粒体 细胞凋亡 CtyC 释放TNFR 的信号转导 TNF- 三聚体与 TNFR 的结合引起受体多聚化,同时受体胞浆区 DD 也发生多聚化,这种多聚化 DD 可与胞浆中 TRADD 分子通过 DD 间相互作用发生结合。 TRADD 的募集可以引起两条信号转导通路:一条是通过 FADD 导致细胞凋亡,一条是通过 TRAF2 和 RIP 诱导 NF-B 和 AP-1 的活化,参与抗凋亡 NF-B 转导细胞存活信号,通过表达 FLIP(与 caspase

27、结构相似,无酶活力的蛋白)抑制 caspase 8 前体活化,细胞不凋亡 TNFR 只有在蛋白合成受阻的情况下才会诱导凋亡。内源性线粒体途径的关键步骤是细胞色素 C 从线粒体膜间隙释放到细胞浆 线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径 促凋亡基因活化 细胞色素 C 细胞色素 C+Apaf-1+ caspase9凋亡体 抗凋亡成员能与促凋亡成员相互作用而抑制促凋亡成员的功能线粒体释放细胞色素 C 的模型 Bax 和 Bak 在线粒体外膜上打孔 通过 VDAC(voltage-dependent anion channel)在线粒体外膜上形成通道 使线粒体外膜上天然存在的 ATPADP 转运蛋白孔道保持开放

28、状态,使细胞色素C 从线粒体膜间隙穿过外膜进入胞浆细胞色素 C 的作用 进入胞浆的细胞色素 C 与 Apaf1、ATP/dATP 结合成复合物,称凋亡体 Apaf1 通过分子中的胱天蛋白酶募集域(CARD) 与 caspase 9 前体原域中的 CARD相互作用而募集 caspase 9 前体,富集的 caspase 9 前体自我激活凋亡途径有正、负调节 正调节有 caspase 8 和 9 前体的自我激活和胱天蛋白酶级联中的酶促放大作用 负调节作用有 FLIP 抑制 caspase 8 前体的活化和 Bcl-2 家族中抗凋亡成员阻断促凋亡成员的作用 抑制 caspase 的凋亡抑制物( IA

29、P)分子中有 1 到 3 个 BIR 域,有保守的 CX2CX16HX6C 序列,可以形成锌指样结构BIR2 域的 IAP 可与 caspase 3 和 7 结合并抑制它们的活性BIR3 域的 IAP 可与 caspase 9 结合并抑制它们的活性 Smac 或称 DIABLO 能与 IAP 的 BIR 域结合从而抑制 IAP细胞凋亡的两条途径间存在串话 caspase8 细胞有足够 caspase8 细胞 caspase8 浓度不够 死亡受体活化, 切割 Bid tBid 从胞质到线粒体 细胞凋亡 CtyC 和 Smac/DIABLO 释放内源性凋亡途径细胞凋亡与人类疾病 细胞凋亡受抑制有关

30、的疾病 恶性肿瘤:滤泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病 自身免疫性疾病:系统性红斑狼疮、肾炎 病毒感染性疾病:腺病毒病、庖疹病毒病 细胞凋亡增多有关的疾病 艾滋病: 神经变性性疾病:早老性迟呆、帕金森病、小脑退化病 骨髓发育不全性疾病 缺血性疾病 酒精中毒性肝炎八. 细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡的形态学检测 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V 法)三、线粒体膜势能( mt)的检测 四、DNA 片断化检测 五、TUNEL 法 六、Caspase-3 活性的检测 七、WB 检测八、凋亡相关蛋白 TFAR19 的表达和细胞定位分析 细胞凋亡的形态学检测1 光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,呈新月状附在核膜周围。2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的 DNA 特异性染料有:HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。3 电子显微镜观察

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