1、中文译文黑曲霉利用香蕉提取物生产柠檬酸摘要：将香蕉提取物作为碳源进行柠檬酸生产的实验。使用的是微生物黑曲霉菌株。对不同类型的生物反应器进行了测试：泡沫柱反应器和搅拌反应器，对于搅拌反应器两种不同类型的叶轮在不同转速的条件下进行了研究：六片桨叶的涡轮桨和赖特宁架 A310 涡轮。在测试过程中对各个参数进行了测量：生化性能（生物量 w/v 和霉的直径） 、化学性能（总糖和柠檬酸的浓度）和物理性能（溶解氧分压 DOT；氧摄取率 OUR；粘性；气体/液体的体积传质系数， )。aKL结果表明柠檬酸的产量与微生物的形态有严格的联系；霉必须以颗粒的形式生长，如在泡沫柱反应器总提供温和的环境中进行；另外，随着
2、机械的搅拌，霉的颗粒状态被破坏，霉的形态变为丝状，并且柠檬酸的产量明显减少。对发酵结果进行讨论，以达到更好的了解影响扩大生产规模的主要因素。关键词：柠檬酸、黑曲霉、混合、泡沫柱反应器、搅拌器、叶轮、农业产品、物理参数注释：溶解氧浓度（千克 /立方米）LC平衡溶解氧浓度（千克/立方米）*校准溶解氧浓度（千克/ 立方米）LSD 叶轮直径（mm）D 颗粒的平均直径 mmDOT 溶解氧分压DOT* 平衡溶解氧分压溶解氧分压的变化在图表 2 区域 c 中(1/s)cdtOT溶解氧分压在图表 2 的区域 a 中aDOT平均流速梯度vG体积传质系数（1/s)KLN 搅拌转速（每分钟转数）功率数P抽号QOUR
3、 氧摄取率（千克/立方米小时）P 柠檬酸浓度（千克/立方米）体积功耗（瓦/立方米）0Q 体积气体流速RI 流变指数S 底物浓度（千克/立方米）T 时间（秒，小时，天）T 温度（）X 生物量浓度(千克/立方米）生物产量SY/柠檬酸产量P/液体表观粘度备注：o 初始条件f 最后条件简介：最近在先进的工业国家，柠檬酸消耗量的增加主要是在食品和制药工业（约占到总需求的 70%）方面，以及用于生物降解，用于生物降解的这种性能表明柠檬酸能够代替磷作为洗涤剂从而能控制环境的污染。这些需求似乎预测在将来柠檬酸有一个更大的需求。在这种情况下，利用农业残留物作为碳源生产柠檬酸似乎是对于柠檬酸生产和废物回收处理这两
4、个问题解决的恰当选择。在关于经过深层通风发酵进行柠檬酸生产的报告中，由选定的黑曲霉或者念珠菌进行碳源（葡萄糖、蔗糖糖浆、甘蔗和甜菜糖蜜、水解淀粉）的生物氧化。最广泛应用的工业微生物是黑曲霉，因为它能在极端的 PH=2 时生产能力仍然能够增长，并且不产生有毒物质，同时能够抑制黄曲霉。使用最广泛的工业原料是甜菜糖蜜，这种甜菜糖蜜是蔗糖生产的副产品。然而，在最几年，随着制糖过程的能力的提高，糖浆中的糖分的总量减少，所以糖浆的发酵能力也降低了。所以在最近几年，人们提出了用水解淀粉进行生产的新的工艺。在这种情况下，可以考虑利用农业废弃物。对于黑曲霉来说，蔗糖、果糖和葡萄糖都是最好的发酵碳源，而这些糖类又
5、是成熟水果的主要成分。这表明可以使用水果作为发酵培养基的碳源。之前，通过使用黑曲霉进行的农业废弃物（尤其是香蕉属）的生物氧化已经表明使用单孢子技术的可行性。现在我们工作的目的是检查在实验室规模的生物反应器中进行的柠檬酸的生产，然后来确定与利用香蕉提取物来进行大规模生产柠檬酸之间存在的主要的问题。为了实现这个目标，不同类型的反应器（充入空气或者氧气的鼓泡器，配置不同类型的叶轮的搅拌器）已经被用来创造这种可以产生颗粒的生产条件，这种生产条件是扩大柠檬酸产量所必需的。研究方法：发酵培养基和微生物之前的研究发现，黑曲霉 B60 似乎是用香蕉类原料生产生产柠檬酸的最佳菌株。在这里提到的黑曲霉 B60 已
6、经使用过了；1989 年，皮特发现这种微生物应该保存在麦芽琼脂培养基，放置在 40的环境中。孢子培养需要在温和的舒和约翰逊培养基中，通过使用三次连续的传输媒介。第四次转移的分生孢子通过加入 10ml 0.2%的生理盐水来生产孢子悬浮液，这是用来制备接种的菌株的，接种的孢子悬浮液的量为 2 个孢子/立方米。10在揺瓶的条件下，经过 48 小时后，形成的为微生物颗粒要用无菌水冲洗 5 次，然后接种到反应器中，使得反应器中孢子浓度达到 5 个/立方米。8塞西精制的发酵培养基：香蕉在蒸馏水中煮沸捣碎 2 小时，糖类从中提取出来，然后混合物在转速为 5500 的条件下离心分离出悬浮固体，随后为了抑制如铁
7、离子，尤其是锰离子等重金属离子，向溶液中加入黄血盐。表 1 给出了测试的香蕉提取物的组成。表格 1 香蕉提取物的组成反应器：在批量处理过程 中，我们用到了两种不同类型的反应 器：一种是搅拌式反应器（STR ),扎尔 伯G14 可加入10L 的发酵液；另一种是容量为 2L 的泡沫柱反应器（BCR） 。在这两种反应器中，温度控制在（301）的范围内，测定 PH 值和 DOT 值。在搅拌式反应器中要控制搅拌速度。测试了搅拌式反应器的两种不同的叶轮对于发酵过程的影响：六片桨叶的涡轮桨和赖特宁架 A310 涡轮桨。它们用到了两种不同的进气装置：喷射器在距离底部 55mm 的径向涡轮和钻孔在距离底部 77
8、mm 的轴流式涡轮。在表格 2 中，列出了叶轮的主要的结构和功能的特性。PH 的测定使用探针，同时氧气的测量是通过测定氧气的探针。泡沫柱反应器是由 4 个树脂玻璃制成的管子组装而成的，其直径为 60mm，高度为 30mm，每个管子都有一个小孔，能够接收到测定 PH 和溶解氧以及温度感应器带来的信息。在容器中，安装样品管子。通过一个烧结的有一个 1640um 气孔，直径为 70mm,厚度 4mm 的玻璃圆盘，气体在此扩散。柱子的上部有一个旋转的泡沫破坏器；PH 的测量通过一个汉纳 8424 探针，同时氧气的测量是用一个 96/s 的 537 型氧气计探针测量。图表 1 是两个反应器的示意图：分析
9、和其他测量：在发酵的过程中，测量了几个参数：总糖浓度的测定是通过费林试剂法，柠檬酸的浓度是通过酶学方法，生物量是通过颗粒直径和干重浓度进行测定。第一次的平均值为 30100 颗粒直径测量在 100 倍显微镜下或直接由口径测量而来，后者通过称重在 5500 转速的条件下运行 15 分钟后的 10 毫升样本，用10 毫升自来水冲洗三次，然后在 105 摄氏度的条件下干燥 24 小时。物理测定的方法：溶解氧分压，通过将氧探针插入发酵液中；氧摄取率和气体/液体提及传质系数，通过苹果电脑获得前端动态的手段。我们通过停止氧气的进料（空气或者纯氧气）以及记录溶解氧分压随时间的变化来评估氧摄取总糖 g/l 1
10、10氮 ppm 400磷 ppm 200镁 ppm 130锌 ppm 1铁 ppm 0.1铜 ppm 缺失锰 ppm 0.010PH 5.5率；这个装置能够记录在 2Hz 的频率下溶解氧分压的值。图表 2 中显示了溶解氧分压的一个典型曲线。供气时，氧平衡可以写作：（1）OURCaKdLLt )(*假定沿着反映路径的气相组成为常数。量氧计测量了溶解氧分压的值；饱和条件下的百分数； 可以表示为溶解氧的函数以及校准饱和状态 ：L LSCDTCS)10(（2）dtOtdL忽略了 在测量期间的变化。LSC当停止进气时，方程式（1）的第二个元素变为 0，方程式可以变为（3）cLSdtDOTCUR10假设氧
11、摄取率不依赖于图表 2 中的 (在连续区域 c 中） ；考虑到溶解氧分L压，在停止通气（图表 2 中的 a 区域）前，测量校准的溶解氧分压的值。气液传质系数可以表示为：（4）1*)(acLDOTdtTaK图表 1：搅拌式反应器和泡沫柱反应器的剖视图（A）搅拌式反应器a取样管 b排气喷嘴 c探头和气体喷嘴 d管壁 e气体分布器 f水平拉杆 g换热器挡板 h恒温水进口 i搅拌器 l恒温水出口 m温度探测器（B）泡沫柱反应器a气体出口管 b消泡器 c探头和气体喷嘴 d气体出口管 e气体分布器 f取样管图表 2 ：在一个氧摄取率的条件下，典型的溶解氧分压的变化1气体入口停止时间 2气体入口开始时间a发
12、酵区域 b脱气区 c直线下降区域 d 限制区域 LCe通气区域如果在发酵过程，氧探头校准气相相同，那么 = 并且 DOT*=100。LS*在方程式 4 中方程式 1 的瞬间状态可以不必考虑，因为这被证实是可以忽略不计的。图表 2 中实际的曲线的形状取决于记录装置的弛豫时间，即探头的反应时间和搅拌系统的反应能力。已经证实了空隙时间与 没有关联。Koizumi and Aiba 发现：在直线LC区域的曲线斜率，氧摄取率和 的测定几乎不受弛豫时间的影响。aK为了测定 和 ，运用了两种不同的方法：一种是依赖于压力测量的物LS*理方法，第二种是依赖于测定液相中氧气的浓度的酶学方法。第一种方法更加准确，但
13、是需要数量较大的样本（100ml） ；酶学方法只需要 20ul 的样品，但是操作复杂，不易重现。由于以上原因，我们采用第一种方法。图表 3 是一个使用设备的示意图：图表 3：测量 的实验装置LSCA气体区域 B液体区域a储气气球 b 温度探头 c玻璃盘 d底阀 e电磁搅拌器1恒温槽出水口 2气体流动管 3压力计 4真空泵在不同糖浓度的条件下测量 ，结果在表格 3 中。按照奎克的观点，他LSC可能能够确定 与糖浓度的关系，正如表格 4 中所表示的系时候的香蕉提取LSC物。 在每一个发酵过程的开始和结束都要测量。LS液体培养基的表观粘度可以通过仪器来确定。该方法实在一直旋转速度的前提下，依赖于扭转
14、阻力测量的。温度的控制是在 300.5的恒温槽中进行。实验测试表格 4 列出了搅拌式反应器和泡沫柱反应器的操作条件。实验用泡沫柱反应器进行了测试，重复使用了纯氧来确定更高的氧分压的影响。用同样的发酵培养液来测试这 6 个所有项目；发酵培养基是从单一的香蕉批次中获得的，然后再添加化学成分达到表格 1 中列出的成分。通过在 120的条件下加热完整的培养基 0.5h,以达到灭菌的目的。对于所有的测试，采用同时抽样的方法，前 48h 取出 15120ml 的发酵样品（根据测量的参数） ，之后每 4 个小时，然后每 12 个小时取出发酵液。测量每个样品的总糖和柠檬酸的浓度，生物量干重和颗粒平均直径。也要
15、测量下面的屋里参量：PH 值，DOT，OUR 和 ，同时液体表观粘度也要每隔aKL24 小时测量一次。表格 5 中是每个试验的初始条件。表格 3：在不同发酵培养基中氧气的饱和值表格 4：试验过程的物理条件表格 5：试验的初始条件表格6：试验的主要结果结果和讨论：在表格 6 中显示了用不同的反应器配置进行的留个试验获得的主要结果。使用泡沫柱反应器获得了柠檬酸的最高产量：50%的发酵糖可以转化为柠檬酸。用搅拌式反应器获得了最低的产量；事实上，搅拌式反应器的产量值表明径向桨搅拌器不论是高速还是低速都会造成柠檬酸产量的明显降低（大约 4.5%） 。然而，使用轴向桨搅拌器的柠檬酸产量依赖于入口的搅拌速率
16、：在低速 400rpm时产量为 26.4%，高速 700rpm 时，产量为 10.6%。关于生物产量，表格 6 表明产量几乎不受搅拌的影响：几乎所有的试验的值都达到了 16%18%。SXY一个更加详细的关于在搅拌式反应器与泡沫柱反应器的形态的研究结果表明：像在泡沫柱反应器这样的温和的条件下，接种的菌种可以继续生长成小团的球状和分支的菌丝。另一方面，在搅拌式反应器中，机械搅拌会引起菌种的破坏，所以菌种会生长成丝状。生物的形态对于发酵液(培养基和菌种）的流动性影响很大：在搅拌式反应器开始运动后，发酵液粘度很明显的增加，然而 的值却下降，在某些情形LSC下会为 0，如图表 6 所示。观察到颗粒类型的
17、形态的菌体时， 值总是远大于LS0，柠檬酸产量总是很高。这些实验数据表明溶解氧浓度在调节代谢途径中起到了重要的作用。图表 7 表明：数据 1 和数据 6 时糖类、柠檬酸和生物量的浓度的变化：在数据 1 中，可以看到糖类生产其他的、没有被探测到的物质，而不是柠檬酸。关于在发酵过程中的生物量的习性，图表 8、9、10 表明了在发酵过程中主要的特征量的变化。图表 8 中：在发酵过程的第一个 1530h 内，微生物特别活跃，氧气的消耗量也增加；随后，氧气的消耗量会减少到一个常数值。这种现象似乎是不受反应器配置的影响；可以假定是一些化学因素影响了微生物来解释这种现象，例如道森提出的氮源缺乏。图表 9：在
18、生产柠檬酸过程中的第一天发酵过程，微生物特别活跃，随后微生物的活性变弱，在某些情况下会停止。反应器的配置能明显地影响这种现象：在较高的速率下（曲线 2，3，4）的特定的生产力在 4060 小时内会下降到 0；在较低的剪切力下（曲线 1，5，6） ，当第五浓度低于 20kg/m时，生产力会下降到 0。关于微生物的生长量受液体表观粘度的影响，图表 10 中表明了流变指数(RI)在发酵过程的变化。图表 11 表明 值的变化 :与去他的试验随时间的变化曲线相类似。在aKL值迅速减少的第一个时期观察到，它们的值在发酵过程中几乎不变。aKL结论所用黑曲霉 B60 和香蕉提取物作为碳源生产柠檬酸。发生在实验
19、室的生物反应器中的试验给了我们进行大规模生产柠檬酸有用的实验结果。涉及到微生物生长形态的结果：球状微生物是获得柠檬酸生物积累的必要条件。麦兹和库森强调：用球状黑曲霉进行的生产依赖于很多因素，如重金属。但是发酵的类型起到最重要的作用。事实上，在这三个搅拌系统的试验中，气泡涡轮桨、轴向涡轮将和径向涡轮桨。通常来说第一个最为有效。这些结果与恰兹用不同的培养基得到的结果一致；但是结果却与戈麦兹的结果不一致，他是通过将搅拌器的速度从 450rpm 增大到 1000rpm 获得了较好的球状结构和较高的柠檬酸产量。在最好的情况下，在发酵的最后阶段柠檬酸的密度为 45kg/m，柠檬酸的产量为 40.9%。通过
20、使用纯氧气代替空气，柠檬酸的产量会增加到 50%。因此，氧气供应是另一个重要的因素：在微生物的生长和柠檬酸生产中，氧气必须充足。任何氧气供应的中断都可以引起柠檬酸生产系统的不可逆的减产。因此，值尤其重要，这不仅与微生物的生存能力有关，也与柠檬酸生产量的增长aKL有关。图表 4：溶解氧浓度平衡的条件与糖浓度的关系。香蕉提取培养基，30，760mmHg图表 5：发酵 7 天后菌种的菌丝致谢：这个试验的进行获得了 MPI40%的资金支持。参考文献Bartolomew, W. H., Karow, E. O., Slat, M. R. & Wilhelm,R. H. (1950). Oxygen tr
21、ansfer and agitation in submerged fermentation: mass transfer of 02 in submerged fermentation of Streptomyces griseus. Ind. Eng. Chem., 42, 1801-10. Dawson, M. W., Maddox, I. S., Boag, I. F. & Brooks, J. D. (1988). Application of fed-batch Culture to citric acid production by A. niger: the effect of
22、 dilution rate and dissolved oxygen tension. Biotechnol. Bioeng., 32,220-26. Gomez, R., Schnabel, I. & Garrido, J. (1988). Pellet growth and citric acid yield of Aspergillus niger 110. Enzyme Microbiol. Technol., 10, 188-91. Hixon, A. W. & Gaden, E. L. (1950). Oxygen transfer in submerged fermentati
23、on. Ind. Eng. Chem., 42, 1792-1801. Hossain, M., Brooks, J. D. & Maddox, I. S. (1984). The effect of the sugar source on citric acid production by A. niger.Appl. Microbiol. Biotechnol., 19, 393-7. Jordan, J., Ackerman, E. & Berger, R. L. (1956). Polarographic diffusion coefficient of oxygen defined
24、by activitygradient in viscous media. J. Am. Chem. Soc., 78, 2979-83. Koizumi, J. & Aiba, S. (1984). Reassessment of the dynamic method. Biotech. aKLBioeng., 26, 1131-33. Metz, B. & Kossen, N. W. (1977). The growth of molds in the form of pellets - A literature review. Biotech. Bioeng.1 9, 781-99. M
25、ilsom, P. H. & Meers, J. L. (1983). Citric acid. In Comprehensive Biotechnology, Vol. 3, ed. M. Moo Young. Pergamon Press, Oxford, pp. 665-80. Mislivich, P. B. (1981). Mycotoxine production by conidial fungi. In Biology of Conidial Fungi, ed. G. T. Cole & B. Kendrik. Academic Press, New York, pp. 37
26、-74. Perquin, L. H. C. (1938). Dissertation, Technical University of Delft, Netherlands. Pitt, J. I. (1985). Media and incubation condition for Penicillium and Aspergillus taxonomy. In Advances in Penicillium and Aspergillus Systematics, ed. R. A. Samson & J.I. Pitt. Plenum Press, New York, pp. 93-1
27、03. Qazi, G. N., Gaind, C. N., Chaturvedi, S. K., Chopra, C. L.Tfiiger, M. & Onken, U. (1990). Pilot-scale citric acid production with Aspergillus niger under several conditions. J. Ferment. Bioeng., 69, 72-4. Quicker, G., Schumpe, A., K6nig, B. & Deckwer, W. B. (1981). Comparison of measured and ca
28、lculated oxygen solubilities in fermentation media. Biotechnol. Bioeng., 23, 635-50. Rohr, M., Stadler, P. J., Saltzbrunn, W. O. S. & Kubicek, C. P. (1979). An improved method for characterization of citrate production by conidia of Aspergillus niger Biotechnol. Letters, 1, 281-6. Rohr, M., Kubicek,
29、 C. P. & Kominek, J. (1983). Citric acid. In Biotechnology, Vol. 3, ed. H. J. Rehem & G. Reeds. Verlag Chemie, Basel, pp. 419-54. Sassi, G. (1990). Produzione di acido citrico da scarti agroalimentari. PhD Thesis, Politecnico di Torino, National Library, Roma. Sassi, G., Ruggeri, B., Specchia, V., S
30、cannerini, S. & Gianetto, A. (1989). Citric acid production from agricultural wastes: a biochemical feasibility test by A. niger v. Tieghem. Minerva Biotechnol., 1, 23-32. Shu, P. & Johnson, M. J. (1947). Effects of the composition of the sporulation medium on citric acid production by Aspergillus n
31、iger in submerged culture. J. Bacteriol., 54, 161-7. Shu, P. & Johnson, M. J. (1948). The interdependence of medium constituents in citric acid production by submerged fermentation. J. Bacteriol., 56,577-85. Slininger, P. J., Petrosky, R. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. & Okos, M. R. (1989). Meas
32、urement of oxygen solubility in fermentation media: a colorimetric method. Biotechnol. Bioeng., 33,578-83. Snell, E D. & Snell, C. T. (1953). Colorimetric Method of Analysis, 3rd edn, Vol. 3. Van Nostrand, New York, pp. 195-250. Verhoff, F. H. (1986). Citric acid. In Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th edn, Vol. A7. VCH, Weinheim, pp. 103-8. Weetman, R. J. & Oldshue, J. Y. (1988). Power flow and shear characteristics of mixing impellers. In BHRA Proc. 6th Eur. Conf. Mixing, 22-26 May 1988, Pavia, Italy, pp. 43-50.
