1、形貌分析与实验,-显微分析,胡海龙 email:,主要内容,1 显微分析的发展及应用2 光学显微镜3 扫描电子显微镜（SEM）4 透射电子显微镜（TEM5扫描探针显微镜（SPM）,第一讲：显微分析的发展及应用,一、显微观察的发展历史,1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。,17世纪中叶，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，成为现代显微镜的鼻祖。,1928年，恩斯特鲁斯卡用电子代替光制作了一个显微镜，能够把实物放大17倍。1932年，德国柏林工科大学高压实验室的M.Knoll和E.Ruska研制成功了第1台实验室电子显微镜，这是后来透射式电子显微镜（transmi
2、ssion electron microscope，TEM） 的雏形。,早在1935年，Kn- oll在设计透射电镜的同时，就提出了扫描电镜的原理及设计思想。1940年英国剑桥大学首次试制成功扫描电镜。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产商品扫描电镜。,1982年国际商业机器公司苏黎世实验室Gerd Binning和Heinrich Erihrer 发明出第一台扫描探针显微镜扫描隧道显微镜,二、显微分析,通过获得的形貌分析物体的几何形状和大小，组织结构及分布，表面状况。所用的分析方法主要有：光学显微镜（optical microscopy）透射电子显微镜（ transmission el
3、ectronic microscopy)扫描电子显微镜(scanning electrons microscopy)扫描探针显微镜 (scanning probe microscopy)场发射离子显微镜 (Field emission ion microscopy),观察物体微观表面形貌，获得微观下物体形貌信息，并分析微区表面其他特性。观察物体微观内部形貌，获得微观下物体内部的空间结构。,三、显微分析的研究内容：,微电机系统（MEMS）：MEMS是微机电系统的缩写。MEMS主要包括微型机构、微型传感器、微型执行器和相应的处理电路等几部分，它是在融合多种微细加工技术，并应用现代信息技术的最新成果
4、的基础上发展起来的高科技前沿学科。用MEMS技术制作的微传感器、微执行器、微型构件、微机械光学器件、真空微电子器件、电力电子器件等在航空、航天、汽车、生物医学、环境监控、军事以及几乎人们所接触到的所有领域中都有着十分广阔的应用前景。目前MEMS市场的主导产品为压力传感器、加速度计、微陀螺仪、墨水喷咀和硬盘驱动头等。,一、介绍,研究人员在活细胞内的能源机制启发下，制造出了一种分子马达。这种微型马达以三磷酸腺苷酶为基础，依靠为细胞内化学反应提供能量的高能分子三磷酸腺苷（ATP）为能源。,分子马达，又名分子发动机，是分布于细胞内部或细胞表面的一类蛋白质，它们的构象会随着与ATP和ADP的交替结合而改
5、变，ATP水解的能量转化为机械能，引起马达形变，或者是它和与其结合的分子产生移动。就是说，分子马达本质上是一类ATP酶。例如肌肉中的肌球蛋白会拉动粗肌丝向中板移动，引起肌肉收缩。而另外两种分子马达：驱动蛋白和动力蛋白，它们能够承载着分子“货物”-如：质膜微粒，甚至是线粒体和溶酶体，在由微管构成的轨道上滑行，起到运输的作用。,纳米发光二极管。,将碳纳米管悬浮在表面氧化的硅薄片上，这使得碳纳米管和硅薄片之间的电场极强，激发形成强光。这种碳纳米管光源比普通的发光二极管每秒多产生10万倍的光子，效能比以前制造的碳纳米管高1000倍。 另外碳纳米管有非常好的特性，其电导率，刚性，热导率都大大优于传统的金
6、属。很多科研人员正在利用碳纳米管研制各种电子器件。,第二讲 光学显微镜,光学放大原理光学显微镜的成像光学显微镜的观察方法及应用,金相显微镜,生物及偏光显微镜,荧光显微镜,一 、透镜成像原理凸透镜成像的规律,1.当u2f时，凸透镜成倒立、缩小的实像 2.当u=2f时，凸透镜成倒立等大的实象 3.当fu2f时，凸透镜成倒立、放大的实像4.当u=f时，凸透镜不成像 5.当uf时，凸透镜成正立放大的虚像,5种典型情况,物镜,目镜,显微镜为复式放大结构,、当fu2f时，在凸透镜像方一侧成倒立、放大的实像（物镜放大）,、当uf时，通过在凸透镜像方一侧可观察到在物方一侧有正立放大的虚像（目镜放大）,二、 显
7、微镜的基本结构及成像原理,3、 显微镜的放大倍数：物镜放大倍数目镜放大倍数,三、显微镜的基本参数数值孔径（Numerical Aperture, N.A.): N.A.=nsin分辨率（Resolving power）： =0.61/N.A工作距离（Working Distance, W.D.)总放大率（Magnification）:,物镜数值孔径(N.A),TOP值: 干系物镜(0.95),水浸物镜(1.2),油浸物镜(1.4),特制物镜(1.6),介质折射率越大，NA值越高开口角越大，NA值越高n=物镜与被检物体之间介质的折射率,数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是由物体与物镜间媒质的
8、折射率n与物镜孔径角的一半（a2）的正弦值的乘积，其大小由下式决定：N.A=n*sin a/2,物镜数值孔径(N.A),数值孔径与显微镜其他参数的关系,物镜的数值孔径是显微镜中最重要的参数.决定和影响着其他参数数值孔径与分辨率成正比数值孔径与放大倍率成正比数值孔径的平方与图象亮度成正比数值孔径和视场直径成反向关系数值孔径与工作距离成反向的关系,分辨率,基础知识,根据“瑞利”判据，当A、B两点靠近到使像斑的重叠部分达到各自的一半时，则认为此两点的距离即是透镜的分辨本领；由此得出显微镜的分辨本领公式（阿贝公式）为：d=0.61/(Nsin)，其中， N A 其最大值为1.3。因此，上式可近似化简为
9、：d=0.5 光镜采用的可见光的波长为400760nm，决定了光学显微镜的分辨本领只能达到200nm,提高分辨率的有效办法,基础知识,1.降低光源波长2.增大介质系数或提 高物镜NA值3.增大物镜的口径4.增加明暗反差,Resolution (r) = 0.61/ NA （ =光源波长，一般选550nm）,目 镜,光学显微镜基础知识,二次放大，不改变分辨率,配合物镜决定目视观察时视场的大小。,四、光学显微镜常见的观察方法,金相观察方法生物及偏光显微分析荧光标记,1. 反射金相观察方法,反射金相观察方法主要是利用物体表面的反射光对物体进行形貌分析，是研究材料内部组织和缺陷以及表面的主要方法之一。
10、利用金相显微镜将试样放大100-1500倍来研究材料内部组织的方法称为金相显微分析法，是研究材料表面微观结构最基本的一种实验技术。,金相显微镜的照明光路是：将一束平行光通过目镜投射到样品表面，再由样品表面反射如物镜放大，由于样品表面不同微区的凹凸以及吸光性不同，导致不同微区反射到物镜中的光的强度、角度以及颜色不同，经过物镜放大，我们就可以观察这些微区的表面特性。,金相显微镜鉴别分析物相的方法如下： (1)明视场观察 明视场是金相显微镜的主要观察方法。入射光线垂直照射在试 样表面，利用试样表面反射光线进入物镜成象。 可观察样品的显微组织，物相的形状，大小，分布及数量。 借助各种化学试剂，显示样品
11、的组织。 还可与各种标准评级图对比，进行钢中晶粒度和显微组织缺陷评级。 (2)暗视场观察 暗视场是通过物镜的外周照明试样，并借助曲面反射镜以大的倾 斜角照射到试样上。 若试样是一个镜面，视场内是漆黑一片。在试样凹洼之处或透过透明夹杂而改变反射角，光线才有可能进 入物镜，而被观察到。因此在暗场下能观察到夹杂物是否透明。,金相显微镜的表面观察特性:,金相显微镜的用途：,金属材料金相组织观察生物表面形貌观察集成电路形貌观察样品表面形貌观察,偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能
12、，而必须利用偏光显微镜。,偏光显微分析的特点,将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域，在生物学和植物学也有应用，如在矿物方面可以研究矿物的双折射现象，偏光性，矿粒。在化学和生物中可研究组织晶体物质及纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等的光学性质，及液晶分子的织构特性等。,2. 晶体光学极偏光显微分析,自然光和偏振光,自然光：垂直于光的传播方向振动，在垂直于光的传播方向的平面内的任意方向振动。,偏振光：垂直于光的传播方向振动，且只在垂直于光的传播方向的平面内的某一方向振动。,
13、光在晶体中的传播,光性均质体与非均质体,光性均质体(各向同性介质)光波在均质体中传播时，其传播速度不因振动方向而发生改变,光性非均质体(各向异性介质),光波在非均质体中传播时，其传播速度随振动方向不同而发生变化。一轴晶和二轴晶。,双折射现象,例如：白纸上涂一个黑点，将方解石放在纸上，可观察到两个黑点，旋转方解石，一个黑点不动，另一个黑点旋转。,这种一束自然光穿过各向异性的晶体（如方解石晶体）时分成两束偏振光的现象称为双折射现象。,偏光显微镜,正交偏光镜下晶体光学性质,正交偏光镜组成 （使用上、下偏光镜）正交偏光镜下晶体光学性质 消光现象、干涉色、光率体轴名、 双折射率、消光类型、延性符号、 双
14、晶,消光现象 全消光、四次消光,干涉现象,干涉现象光的干涉条件：两束光振动频率相同，均同一平面内振动，且存在光程差。,PP：下偏光方向AA：上偏光方向：光率体主轴与下偏光交角K1、K2：透过晶体后的偏振光K1、K2：透过上偏光镜的光,干涉色等级第一级：0-560nm 各色光具一定亮度，有一级白，无蓝色与绿色。第二级：560-1120nm 颜色鲜艳，色带之间界限较清楚。第三级： 1120-1680nm 颜色不如二级鲜艳，色带之间的界限不清楚。第四级：1680nm以上 色调很淡，色带之间逐渐过渡，无明显界限。五级以上，呈高级白。,正交偏光下的晶体光学,3. 荧光标记,荧光标记是利用一个高发光效率的
15、点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的荧光标记观察。,荧光显微镜,Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green,用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,利用荧光染料检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（5580），所以可将其染色而被检测到。被支原体污染的细胞经染色后在细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA染色斑，说明有支原体污染。,荧光标记观察,思考题：,1. 光学显微镜的最大分辨率是多少？ 光学显微镜的分辨率与哪些参数有关？,2. 自然光与偏振光有什么区别？,3. 在正交偏光下，晶体切片有几次消光？为什么均质体在正交偏光下全消光，而非均质体只有在特殊位置消光？,The end! Thank you！,
