1、一 PCR技术,PCR概念 PCR的原理 PCR中的注意事项 PCR的主要类型,什么是PCR?,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异片段的技术。 PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。,PCR反应的几个要素,DNA聚合酶 生产机器 模板（要扩增的DNA） 引物 dNTPs 原料 Buffer（缓冲液） 稳定的环境 Mg 2+ 等 润滑剂,模具,PCR反应步骤,模板DNA,变性(dena
2、turaion),引物1,引物2,退火(annealing),引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,延伸(extension),第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA（1）,第1轮扩增（2）,第2轮扩增（4）,第3轮扩增（8）,第4轮扩增（16）,第5轮扩增（32=25）,标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L 上下游引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L,1）PCR反应成分,（1）模板模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR），既可以是
3、双链，也可以是单链。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）,DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等 存在的情况下催化DNA的合成。Taq酶来自水生嗜热菌 Thermus aquaticus特点：1.良好的耐热性在7080具有最高聚合活性在95 仍然可以有50%活性2. Mg2+依赖性3. 扩增时3末端凸出一个A 碱基3. 无校正功能一般PCR中酶的用量为0.5-2.5 U/50 l，酶量增加使反应 特异性下降，酶量过少影响反应
4、产量。,（3）引物引物浓度：0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。引物设计： （1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%。 （4）引物Tm在50-65之间，两条引物的Tm应接近，不能相差太大。 （5）引物内部避免形成二级结构。,（6）两引物间避免有互补序列。 （7）引物3端与模板序列要严格配对，3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5端无严格限制。,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,（4）dNTPdNTP： dATP， dTTP， dGT
5、P， dCTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,（6）缓冲液（Buffer）,10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.
6、3,室温）50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性0.01% 明胶 保护酶不变性失活,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链95oC 20-30秒 (2) 退火 退火温度由引物Tm值决定，一般为Tm 510增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸70-75oC(温度取决于聚合酶的活性）延伸时间由扩增片段长度及DNA聚合酶的延伸速度决定 （4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,一个典型PCR体系,反应体系（50 ul）：Taq酶 2.5 U 10x Buffer 5 u
7、l dNTP(2.5mM) 4 ul DNA模板 0.12ug 上游引物(10P) 2 ul 下游引物(10P) 2 ulH2O 补足至50 ul总计 50 ul,反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）：95 5 min95 30 s55 30 s72 1 min72 5 min4 -,30个循环,PCR的特点,特异性强 灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10 - 12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10 -6)水平 简便、快速PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,4.对标本的纯度要求低：不需
8、要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测,PCR常见问题,假阴性，无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对 策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现
9、的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,原因,对 策,重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,非特异性扩增,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数
10、,拖尾,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分,注意的事项：,PCR的类型及应用,研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断
11、 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他,PCR的不同类型,重组PCR 不对称PCR 反向PCR 多重PCR 原位PCR 连接酶链反应 巢式PCR 递减PCR 热启动PCR RTPCR 实时定量PCR,重组PCR（基因克隆）,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,限制性核酸内切酶,不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组
12、DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,多重PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应
13、体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,操作步骤 固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶. 蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K. PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置. 杂
14、交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交,原位PCR的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,LCR连接酶链反应,LCR （Ligase chain reaction
15、）基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物.,LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为2026个，以保证引物与靶序列的特异性结合，其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度(Tm)，因而识别单核苷酸错配的特异性极高.LCR的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94min变性和65复性并连接，循环30次左右.
16、 目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等.,LP（Labelled primers)检测,利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,巢式PCR（Nest-PCR）,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特
17、异性。,递减PCR（TouchDown PCR）,递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。,热启动PCR （HotStart PCR）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；,现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高
18、通量应用；,热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。,RT-PCR,RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以RNA 为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA 加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA 最后扩增靶DNA,RT-PCR,逆转录酶,聚合酶,RNA,杂合双链,PCR扩增,RNA,cDNA,反转录引物,逆转录酶： 禽类成髓细胞病毒
19、(AMV)逆转录酶，活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。 鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。 MLV反转录酶兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱。 普通逆转录酶反应温度为37-42度，所以反转录的延伸温度一般都是37或42 。,逆转录反应的一般步骤,RNA模板+反转录引物，70，5min, 冰浴1min。 再加以下反应组分：BufferdNTP逆转录酶抑制剂逆转录酶 以上组分加好后，混匀，42或37 60min。 70，5min 后再冰浴，所得产物
20、就是cDNA， cDNA用做后面的PCR的模板。,一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在
21、单管中进行。,两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。,二 、测序原理,双脱氧核苷酸终止测序法（也叫sanger测序法）的原理是：在PCR体系中加入双脱氧核苷酸（ddNTP）， 在PCR延伸过程中ddNTP随机掺入到合成链中从而导致延伸的终止，经过大量的这样随机终止的PCR反应，生成一系列长度相差1个碱基的PCR产物混合物，此产物通过电泳根据
22、不同长度片段的电泳速度不同来检测整段DNA的序列。,dNTP与ddNTP,双脱氧终止法示意,双脱氧终止法示意,脱氧核苷酸（dNTP）的连接,OH,H,双脱氧终止法示意,脱氧核苷酸（dNTP）的连接,O,碱基,C,P,H,1,2,3,4,5,H,双脱氧终止法示意,双脱氧核苷酸（ddNTP）,双脱氧终止法测序反应组分,模板预备测序的双链或单链DNA 引物在模板上已知区域设计的测序引物，引物确定了测序的方向和位置 dNTP ddNTP脱去3端羟基的dNTP，并且4种不同的ddNTP上标记有4种不同颜色的荧光标记 DNA聚合酶 缓冲液为DNA聚合酶提供工作条件,测序组分示意图,因为颜色不同，4种终止物
23、可以在一起进行反应。,测序反应示意图,在引物延伸反应过程中，dNTP和ddNTP是相互竞争地掺入到延伸链的3端的，因而ddNTP在不同位置掺入，就产生了一系列不同长度的新的DNA片段。,测序PCR产物电泳分离示意图,不同片段长度的测序产物因大小不同而电泳速度不同，从小到大先后通过测序仪的荧光检测窗口，并根据检测的荧光信号颜色来读取通过片段的末端的碱基序列，一系列相差1个碱基的片段依次通过，则就可以读出整个模板片段的序列。,测序仪基本构造示意图,1 电进样及电泳,1. 毛细管和电极深入样品溶液中2. 加电压3. 荷负电的DNA分子进入毛细管在电场作用下向阳极泳动,2 荧光激发和检测,分别带4色荧光标记的DNA片段从小到大依次经过激光检测区2. 激光激发荧光产生长波长的荧光信号3. 荧光信号被冷CCD收集4. 软件将光学信号转换成电泳图谱,76,PCR扩增与DNA测序反应的区别,
